БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 4, с. 259-266
УДК 576.316.32
ЛОКАЛИЗАЦИЯ АНТИТЕЛ К ТОПОИЗОМЕРАЗЕ IIa В НОРМЕ И ПРИ ИСКУССТВЕННОЙ КОНДЕНСАЦИИ И ДЕКОНДЕНСАЦИИ ХРОМОСОМ
© 2008 г. М. И. Мурашева*, Е. И. Кульнева, Ю. С. Ченцов
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет,
119991 Москва, Ленинские горы; факс: (495) 939-43-09; электронная почта: marinak-m@mail.ru, yuchentsov@mail.ru
Поступила в редакцию 01.02.2008 г.
Иммунофлуоресцентным методом изучена локализация ДНК-топоизомеразы IIa (Topo IIa) в интерфазном ядре и в хромосомах in situ на разных стадиях митоза в норме, а также при воздействии конденсирующего и деконденсирующего растворов. В исходных митотических хромосомах культуры клеток M-HeLa in situ после фиксации и пермеабилизации Topo IIa распределяется равномерно по хроматидам. В клетках, подвергнутых воздействию деконденсирующих растворов (10 мМ трис; 0.1 и 0.3 мМ CaCl2 в 10 мМ трис, 15% DMEM; 75 мМ KCl), в профазе, прометафазе и метафазе Topo IIa распределяется равномерно по хроматидам с максимальной концентрацией в прицентромерном районе. В анафазе и телофазе Topo IIa распределяется равномерно по хроматидам. Topo IIa не выявлена в хромосомах клеток, обработанных конденсирующими растворами, содержащими 0.7, 1.0, 2.0 и 3.0 мМ CaCl2 в 10 мМ трис, на стадиях профазы, метафазы и анафазы. В этих же условиях в поздней телофазе во вновь образующихся ядрах выявляется окраска антителами к Topo IIa. При последовательном воздействии на клетки сначала конденсирующего раствора, а затем деконденсирующего Topo IIa распределяется по хромосомам так же, как при действии деконденсирующих растворов: равномерно по хроматидам в анафазе и телофазе, а в профазе, прометафазе и метафазе равномерно по хроматидам с максимальной концентрацией в прицентромерном районе. Возможно, что при воздействии конденсирующих растворов хромосомы не окрашиваются за счет "маскировки" сайтов связывания антител к Topo IIa. Таким образом на невыделенных хромосомах Topo IIa распределяется равномерно по хроматидам; такая локализация сохраняется при гипотонической обработке, но концентрация Topo IIa выше в центромерных участках.
До последнего времени остается неясным вопрос о локализации негистоновых белков ядерного матрикса в составе митотических хромосом. По мнению ряда авторов, одним из главных белков матрикса хромосом является ДНК-топоизомераза IIa (Topo IIa) [1, 2]. Некоторые авторы утверждают, что Topo IIa находится в основании петель ДНК и отвечает главным образом за конденсацию хромосом и их разъединение [3, 4]. Topo IIa связана преимущественно с SAR (scaffold associated re-§юш)-содержащими фрагментами А-Т-богатых районов ДНК, которые, как полагают, находятся в основании хроматиновых петель [3, 5].
Отсутствует и единое мнение о локализации Topo IIa как в хромосомах, так и в интерфазном ядре нативных клеток, поскольку существующие данные получены при различных способах обработки клеток. Например, в исследованиях на живых клетках НЕК 293 (клетки почки эмбриона человека) и LLC-Pk (клетки почки свиньи), экспрессиру-ющих GFP-Topo IIa, показано, что Topo IIa полностью окрашивает хроматиды, а после фиксации
Сокращения: Topo IIa - ДНК-топоизомераза IIa.
* Автор для переписки, электронный адрес: marinak-m@mail.ru.
этот белок равномерно распределен "вдоль центральной оси хроматид", причем особенно ярко окрашивается антителами прицентромерный район [6-8]. Вместе с тем на выделенных хромосомах, в методику получения которых входит предварительная гипотоническая обработка, Topo IIa равномерно распределена вдоль центральной оси хроматид [1, 4, 9, 10-12].
Поскольку большинство данных о расположении Topo IIa получено на препаратах выделенных хромосом, было решено проверить, как зависит расположение Topo IIa от предварительной обработки клеток in situ в различных гипотонических растворах, так как в этих условиях происходит искусственная деконденсация хроматина. Вместе с тем известно, что степень конденсации хроматина зависит также от концентрации двухвалентных катионов. Наибольшим сродством к ДНК обладает Са2+, и взаимодействие ДНК с Са2+ приводит к конденсации хроматина [13].
В представленной работе иммунофлуоресцент-ным методом изучено распределение Topo IIa in situ в митотических хромосомах и интерфазных ядрах одной клеточной линии - в необработанных
259
2*
клетках и при искусственной деконденсации и конденсации хромосом.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Клеточная культура. Работа выполнена на линии клеток рака шейки матки человека M-HeLa (Институт цитологии, Санкт-Петербург, Россия), культивируемой в среде DMEM ("ПанЭко", Россия) с добавлением 10% сыворотки К052 (эмбриональная телячья сыворотка, "ПанЭко") в присутствии антибиотика-антимикотика А5955 ("Sigma", США) в концентрации 1 мл на 100 мл среды. Клетки культивировали при 37°С на покровных стеклах в чашках Петри и использовали на второй день после посадки. Хромосомы изучали непосредственно в клетках без предварительного их выделения.
Экспериментальные воздействия. Для деконденсации нативных хромосом использовали 10 мМ раствор триса ("Sigma") с добавлением 0.1% тритона Х-100 ("Sigma") (pH 7.2); 15% среду DMEM; 75 мМ КС1. Клетки обрабатывали этими растворами в течение 6 мин.
Для конденсации нативных хромосом клетки обрабатывали 3 мМ раствором CaC12 в 10 мМ три-се, содержащем 0.1% тритона Х-100 (pH 7.2), в течение 6 мин.
В экспериментах с конденсацией и последующей деконденсацией хромосом клетки обрабатывали сначала раствором 3 мМ CaC12 в 10 мМ трисе, содержащем 0.1% тритона Х-100 (pH 7.2), в течение 6 мин, а затем 10 мМ раствором трис в течение 6 мин.
Чтобы выяснить характер окраски хромосом при воздействии растворов с разными концентрациями CaC12 использовали растворы CaC12 (0.1, 0.3, 0.5, 0.7, 1.0, 2.0 и 3.0 мМ) в 10 мМ трисе, содержащем 0.1% тритона Х-100 (pH 7.2), в течение 6 мин.
В контроле клетки фиксировали 2% парафор-мальдегидом (PFA) ("Sigma") в фосфатно-солевом буфере (PBS) рН 7.2-7.4 в течение 10 мин
В опытах клетки фиксировали 2% парафор-мальдегидом (PFA) ("Sigma"), приготовленным на используемых в опытах растворах соответствующей тоничности.
Иммунофлуоресцентное окрашивание. Перед обработкой клеток антителами к Topo IIa ("Dako", Дания) проведена дополнительная пермеабилиза-ция фиксированных клеток 0.5% раствором тритона Х-100 на фосфатно-солевом буфере (PBS) рН 7.2-7.4 в течение 10 мин. Затем клетки отмывали 3 раза по 5 мин раствором PBS. Для иммунохими-ческого определения локализации Topo IIa клетки обрабатывали в течение 40 мин при 37°С первыми антителами к данному белку, разведенными в PBS ("MP Biomedical, Inc.", Германия), содержащем 0.1% Tween 20 ("MP Biomedical, Inc.") и 1% бычье-
го сывороточного альбумина ("Sigma"), в соотношении 1 : 50. Затем клетки обрабатывали вторыми антителами, меченными ФИТЦ ("Amersham Life Science", США), разведенными тем же раствором в соотношении 1 : 75 при 37°C в течение 30 мин. Для выявления ДНК препараты окрашивали флуоро-хромом DAPI ("Sigma") в концентрации 1мкг/мл по стандартной методике. Затем препараты промывали и заключали в Moviol ("Calbiochem", США). Препараты просматривали и фотографировали в люминесцентном микроскопе Opton с объективом Neofluar 100 х 1.25.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Контролем служили необработанные клетки культуры M-HeLa. Интерфазные ядра необработанных клеток окрашиваются антителами к Topo IIa не равномерно, а в виде скоплений, с ярким свечением в зоне приядрышкового хроматина. В разных клетках интенсивность флуоресценции ядер неодинакова (рис. 1а). На митотических хромосомах в профазе, прометафазе, метафазе, анафазе и ранней телофазе Topo IIa распределяется равномерно по хроматидам (рис. 1б, в).
Локализация Topo IIa при деконденсации хроматина 10 мМ трис. В клетках, обработанных де-конденсирующим раствором, антитела к Topo IIa гомогенно распределены в интерфазных ядрах, а в зоне ядрышек выявляются нечетко. Интенсивность свечения ядер разных клеток отличается так же, как и в норме (рис. 2а). В профазе антитела к Topo IIa располагаются равномерно по хроматидам с более интенсивно светящимся районом на каждой хромосоме. Подсчет этих ярко светящихся участков показал, что в каждой клетке их примерно 46-48 (рис. 26). В прометафазе и метафазе Topo IIa распределена равномерно по хроматидам, но особенно ярко антителами окрашивается прицен-тромерный район (рис. 2е). В анафазе и ранней телофазе Topo IIa распределяется равномерно по хроматидам (рис. 2г).
Зависит ли такое распределение Topo IIa от состава деконденсирующего раствора, мы выясняли с помощью дополнительных экспериментов с другими растворами.
Локализация Topo IIa при деконденсации хроматина 15% раствором среды DMEM. В интерфазных ядрах клеток, обработанных этим декон-денсирующим раствором, Topo IIa локализуется гомогенно, а интенсивность свечения ядер разных клеток различна (рис. 3а). В митотических хромосомах, как и при воздействии раствора 10 мМ трис, Topo IIa равномерно распределена по хроматидам с более высоким содержанием в прицентромер-ном районе на стадиях прометафазы и метафазы (рис. 36). В анафазе и ранней телофазе Topo IIa распределена равномерно по хроматидам (рис. 3е).
10 мкм
Рис. 1. Локализация Topo IIa в необработанных клетках культуры M-HeLa. Верхний ряд - окрашивание DAPI; нижний ряд - иммунофлуоресцентное окрашивание антителами к Topo IIa. а - Интерфаза, б - прометафаза, в - анафаза.
^ 4
é
I
10 мкм
Рис. 2. Локализация Topo IIa в клетках культуры M-HeLa при воздействии деконденсирующего раствора (10 мМ трис). Верхний ряд - окрашивание DAPI; нижний ряд - иммунофлуоресцентное окрашивание антителами к Topo IIa. а - Интерфаза, б - профаза, в - прометафаза, г - ранняя телофаза.
J
Рис. 3. Локализация Topo IIa в клетках культуры M-HeLa при воздействии деконденсирующего раствора (15% раствор среды DMEM). Верхний ряд - окрашивание DAPI; нижний ряд - иммунофлуоресцентное окрашивание антителами к Topo IIa. а - Интерфаза, б - прометафаза, в - ранняя телофаза.
Локализация Topo IIa при деконденсации хроматина 75 мМ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.