научная статья по теме LUX-БИОСЕНСОРЫ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ АНТИБИОТИКОВ: ВКЛАД АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В БАКТЕРИЦИДНОЕ ДЕЙСТВИЕ АНТИБИОТИКОВ Химия

Текст научной статьи на тему «LUX-БИОСЕНСОРЫ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ АНТИБИОТИКОВ: ВКЛАД АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В БАКТЕРИЦИДНОЕ ДЕЙСТВИЕ АНТИБИОТИКОВ»

ХИМИЧЕСКАЯ ФИЗИКА, 2015, том 34, № 6, с. 58-64

ХИМИЧЕСКАЯ ФИЗИКА ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ

УДК 535.71

Lux-БИОСЕНСОРЫ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ АНТИБИОТИКОВ: ВКЛАД АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В БАКТЕРИЦИДНОЕ

ДЕЙСТВИЕ АНТИБИОТИКОВ © 2015 г. Г. Б. Завильгельский*, В. Ю. Котова, А. С. Миронов

Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва *E-mail: zavilgel@genetika.ru Поступила в редакцию 31.10.2014

На основе бактерий Escherichia coli сконструированы высокочувствительные специфические lux-биосенсоры для детекции антбиотиков тетрациклинового и Р-лактамного рядов, а также хиноло-нов. Бактерии содержат гибридные плазмиды pTetA'::lux, pAmpC'::lux, pColD'::lux, в которых транскрипция генов-репортеров luxCDABE Photorhabdus luminescens осуществляется с индуцируемых промоторов генов tetA, ampC, cda соответственно. Проведено измерение основных характеристик (пороговая чувствительность, амплитуда и время ответа) lux-биосенсоров. Определен вклад активных форм кислорода в бактерицидное действие антибиотиков — хинолонов.

Ключевые слова: биосенсор, люцифераза, биолюминесценция, индуцируемый промотор, антибиотик, активные формы кислорода.

DOI: 10.7868/S0207401X15060126

ВВЕДЕНИЕ

Lux-биосенсоры широко применяются в генетической инженерии и биотехнологии, а также для мониторинга состояния окружающей среды [1—4]. Lux-биосенсор — это бактериальная клетка, содержащая гибридную плазмиду, в состав которой встроены два основных элемента: регуляторный участок (промотор и оператор) и ген(гены)-репор-тер [3, 5]. В работе [5] на основе бактерий Escherichia coli были сконструированы высокочувствительные специфические lux-биосенсоры для детекции ионов металлов и металлоидов (ртуть, кадмий, серебро, медь, мышьяк, сурьма). В качестве генов-репортеров использовались гены luxCDABE, изолированные из генома наземных бактерий Phothorhabdus luminescens. В настоящей работе представлены lux-биосенсоры для детекции антибиотиков тетрациклинового и ß-лактамного рядов, а также хинолонов и определены их основные характеристики (пороговая чувствительность, амплитуда и минимальное время ответа).

В ряде работ было показано участие гидрок-сил-радикала OH * в летальном эффекте антибиотиков хинолонов, ß-лактамов, аминогликозидов и др. [6—13]. Однако недавно опубликованы работы, в которых роль активных форм кислорода (АФК) в летальном (бактерицидном) эффекте антибиотиков подвергается сомнению [14, 15]. В разрешении данной проблемы принципиально

важен ответ на вопрос о количестве АФК, синтезируемых в бактериальной клетке, обработанной антибиотиком. В норме, т.е. при росте бактерий в отсутствие антибиотика, клеточные системы защиты от пероксида водорода (каталазы KatG и KatE, гидроксилпероксидаза AhpC) и супероксид-аниона (супероксиддисмутазы MnSodA, FeSodB, CuSodC) обеспечивают очень низкий базальный уровень АФК, образуемых в качестве побочного продукта активности ферментов дыхательной системы и не способных повредить ДНК клетки. Для определения временной зависимости индукции супероксид-аниона и количественной оценки его уровня в зависимости от концентрации антибиотика в настоящей работе используется индуцируемый lux-биосенсор — бактерии E. coli, содержащий гибридную плазмиду pSoxS'::lux, ранее сконструированный и охарактеризованный в работе [16].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Бактериальные штаммы и плазмиды

В работе использовали следующие штаммы: Escherichia coli K12: MG1655 F- ilvG rfb-50 rph-1; MC1061 F- araD139 A(ara leu) 7697MacX74 thigalU galK hsdR mcrB rpsL; TG-1 thi relA supE44 hsdR17 hsdMMac-proAB) [F'traD36 proAB lacIqZAM15]; E. coli QC868 F- leu6 thrA1 proA2 thi-1 lacY1 tonA1

rpsL31 supE44 hsdR- Smr ; E. coli QC871 F- leu6 thrAl proA2 thi-1 lacYl tonAl rpsL31 supE44 hsdR— sodA25 sodBA2 Cmr Kanr Smr [17]. Штамм Citro-bacterfreundii ATCC 29063 получен от Р.С. Филипс (R.S. Phillips, США).

Плазмида pColD-CA23 получена от И.А. Хмель (Институт молекулярной генетики РАН, Москва). Штамм E.coli MG1655Z1 содержит в геноме ген tetR, кодирующий белок-репрессор TetR для промотра гена tetA. Этот штамм был получен трансдукцией с помощью фага P1; в качестве донора использовали клетки штамма E. coli DH5aZ1 tetR+, в геноме которого ген tetR сцеплен (90% котрансдукции) с геном, определяюшим резистентность бактерий к спектиномицину.

Были использованы векторы pACYC177, pTZ57R фирмы "Fermentas", а также pDEW201, полученный от T.K. Van Dyk (США). Гибридная плазмида pSoxS'::lux сконструирована ранее [16].

Конструирование гибридных плазмид

ДНК-фрагменты, содержащие промоторы PtetA, PampC, Pcda и соответствующие регуляторные участ-

ки, были получены при помощи полимерной цепной реакции (ПЦР) амплификации нуклеотидных последовательностей из транспозона Tn10, генома Citrobacter freundii, плазмиды pColD-CA23, соответственно, с использованием соответствующих праймеров. На первом этапе полученные ПЦР-продукты были клонированы в векторе pTZ57R. Далее фрагменты ДНК, фланкированные сайтами рестрикции EcoRI и BamHI, встраивали по указанным сайтам в беспромоторный вектор pDEW201 (oricolE и ген-маркер bla (резистентность к ампициллину)), в котором они были транскрипционно слиты с генами-репортерами luxCDABE Photorhabdus luminescens. При конструировании гибридной плазмиды с фрагментом ДНК из генома С. freundii ген-маркер bla в векторе pDEW201 был заменен на ген-маркер kanr (резистентность к канамицину). Для этого в pDEW201 на место гена bla был встроен фрагмент ДНК размером 985 н.п., содержащий ген kanr. Этот ген был предварительно изолирован из вектора pACYC177 с помощью праймеров:

14-nptPstF, 5'-ggCTGCAGgctagactgggcggttttat-3' (28 н.п.), 14-nptPstR, 5'-ggCTGCAGaagatccccttattagaagaact-3' — (31 н.п.).

Сконструированные гибридные плазмиды вводили в клетки различных штаммов E. coli K12. Выделение плазмид, рестрикцию, лигирование фрагментов ДНК, трансформацию клеток проводили согласно методике из работы [18].

Питательные среды и условия роста

Бактерии растили в бульоне Луриа—Бертани (LB), содержащем 100 мкг/мл ампициллина или 40 мкг/мл канамицина. Клетки растили с аэрацией при 30°C до ранней экспоненциальной фазы.

Ферменты и химические вещества

Все химические препараты были аналитической чистоты. В качестве индукторов использовали антибиотики: налидиксовую кислоту, норфлоксацин, тетрациклин, ангидротетрациклин, ампициллин, цефазолин, канамицин фирм "Sigma Chemical Co" (США), "Merk" (Германия), "Biopharm" (Россия). Ферменты для работы с ДНК получены от фирмы "Fermentas" (Литва). Все тест-растворы приготовляли непосредственно перед их использованием.

Измерение люминесцентной реакции lux-биосенсоров

Ночную культуру биосенсора разводили до концентрации 107 клеток/мл в свежем ЬВ и растили с аэрацией при 30°С до ранней экспоненциальной фазы. Затем пробы по 200 мкл переносили в специальные кюветы, одна из которых служила контролем (в нее добавляли 4 мкл дистиллированной воды), а в другие кюветы вносили по 4 мкл антибиотиков в различной концентрации. Приготовленные таким образом пробы с клетками 1их-биосенсора располагали перед фотоумножителем в люминометре ЬМА01 ("Весктап", США) и через определенные интервалы времени измеряли интенсивность биолюминесценции клеточной суспензии. Инкубацию проб проводили при комнатной температуре. Измерение интенсивности биолюминесценции проводили согласно методике из работы [5]. Измеряли три основных параметра, характеризующих качество биосенсора: 1) амплитуду ответа (АО), 2) минимальное время ответа (,т) и 3) пороговую чувствительность.

Амплитуда ответа определяется по формуле АО = (I, — /0)/(/к — /0), где 10 — интенсивность биолюминесценции препарата в момент добавления индуктора (, = 0), 1к — интенсивность биолюминесценции контрольного препарата (отсутствие

нР в 105

ти оц. 104

я 103

ео ти нм 102 101

52 10°

2 5

10 20

0.1 0.2 0.5 1

Концентрация ангидротетрациклина, нг/мл

Рис. 1. Ангидротетрациклин-индуцируемая биолюминесценция lux-биосенсора E. coli MG1655Z1 (pTetA'::lux). Зависимость интенсивности биолюминесценции клеток биосенсора от концентрации ангидротетрациклина в LB-среде. Время инкубации lux-биосенсора — 120 мин.

индуктора) в момент t, I — интенсивность биолюминесценции опытного препарата в момент t. Минимальное время ответа tm определяется интервалом времени между моментом добавления индуктора и моментом фиксации прибором (лю-минометром) достоверного усиления сигнала по сравнению с (1к — 10). Пороговая чувствительность определяется минимальной концентрацией индуктора, при которой АО = 2.

РЕЗУЛЬТАТЫ 1. Lux-биосенсоры для детекции антибиотиков

Для детекции антибиотиков тетрациклинового ряда нами сконструирована плазмида рТе^'::1их, содержащая фрагмент транспозона Тп 10 с промо-торно-операторной областью гена tetA, тран-скрипционно слитой с генами-репортерами 1их-СБАВЕ Р. ¡ит1пезсет. Промотор гена tetA находится под контролем белка-репрессора TetR, который при контакте с молекулой тетрациклина и его производными инактивируется. В результате промотор РША открывается лишь при появлении в

среде производных тетрациклина. На рис. 1 приведена кривая зависимости интесивности биолюминесценции клеток биосенсора E. coli MG1655Z1 (pTetA'::lux) в среде LB от концентрации ангидротетрациклина (время инкубации — 120 мин). Интенсивность биолюминесценции при концентрациях ангидротетрациклина 10 нг/мл и выше превышает базовую интенсивность биолюминесценции (среда без антибиотика) примерно в 1000 раз. Пороговая концентрация ангидротетрациклина, фиксируемая биосенсором, примерно равна 0.5 нг/мл. Минимальное время ответа зависит от концентрации антибиотика и составляет при 10 нг/мл около 10 мин.

Для детекции антибиотиков ß-лактамного ряда сконструирована плазмида pAmpC'::lux (kanr) с геном ampR, кодирующим белок-регулятор AmpR, и с промоторно-операторной областью перед геном ampC, кодирующим ß-лактамазу — основной фермент, разрушающий ß-кольцо антибиотика. Экспрессия гена ampC в геноме бактерий рода Citrobacter индуцируется при появлении в среде антибиотика ß-лактамного ряда, причем белок AmpR является активат

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Химия»