УДК 577.23
МАЛОНАТ КАК ИНГИБИТОР ИНДУЦИРОВАННОГО ЖИРНЫМИ КИСЛОТАМИ ЦИКЛОСПОРИН А-ЧУВСТВИТЕЛЬНОГО КАЛЬЦИЙ-НЕЗАВИСИМОГО СВОБОДНОГО ОКИСЛЕНИЯ В МИТОХОНДРИЯХ ПЕЧЕНИ
© 2015 г. С. И. Адакеева, М. В. Дубинин, В. Н. Самарцев*
Марийский государственный университет, 424001 Йошкар-Ола, пл. Ленина, 1; факс:(836-2) 56-57-81; *электронная почта: samvic56@mail.ru Поступила в редакцию 06.08.2014
В опытах на изолированных митохондриях печени, энергизованных путем окисления сукцината, исследовано влияние ингибитора сукцинатдегидрогеназы малоната на чувствительную к циклоспорину А (ЦсА) стимуляцию дыхания а,ю-тетрадекандиоловой (ТДК) и пальмитиновой кислотами. Установлено, что в присутствии 50 мкМ 2,4-динитрофенола (ДНФ), вызывающего стимуляцию дыхания митохондрий до максимального уровня, малонат в концентрации 0.2 мМ снижает скорость дыхания в 2 раза. Вместе с тем, в этой и даже в большей концентрации малонат не влияет на дыхание митохондрий в контролируемом состоянии (в состоянии 2), а также при условии стимуляции дыхания митохондрий протонофорным разобщителем БССР в 2 раза. ТДК в концентрации 0.5 мМ, также стимулируя дыхание митохондрий в 2 раза, в отличие от БССР не влияет на ДТ как в отсутствие, так и в присутствии малоната вплоть до его концентрации 0.5 мМ. Однако уже в концентрации 0.2 мМ малонат существенно снижает активность ТДК. Показано, что малонат в митохондриях печени одинаково эффективно ингибирует как активность ТДК, так и дыхание, стимулированное до максимального уровня ДНФ. Выяснено, что стимуляция дыхания ТДК не связана с индукцией неспецифической проницаемости внутренней мембраны у части популяции митохондрий печени. Для оценки разобщающего действия пальмитиновой кислоты использовали величины удельной активности пальмитиновой кислоты (Уи) и ее составляющие, характеризующие участие в разобщении ЛБР/АТР-антипортера (УСа1г), аспартат/глутаматного антипортера (К01и) и чувствительной к ЦсА системы (УС8Л). Установлено, что малонат в концентрации 0.2 мМ существенно уменьшает величину Уи и УСкЛ, но при этом не влияет на УСа1г и У01и. На основании полученных результатов предполагается, что ЦсА-чувствительная стимуляция дыхания митохондрий печени ТДК и пальмитиновой кислотой без изменения ДТ может быть обусловлена переключением части комплексов дыхательной цепи на режим переноса электронов с максимальной скоростью без векторного перемещения Н+ из матрикса в межмембранное пространство.
Ключевые слова: митохондрии, свободное окисление, а,ю-тетрадекандиоловая кислота, пальмитиновая кислота.
Б01: 10.7868/80233475515010028
ВВЕДЕНИЕ
Хорошо известно, что в клетках печени животных существенная доля потребляемого митохондриями кислорода (до 30%) не связана с синтезом АТР [1, 2]. Важными физиологическими функциями этого так называемого свободного окисления (или свободного дыхания) у млекопитающих являются продукция тепла для поддержания необходимой температуры тела, а также снижение генерации токсичных активных форм кислорода в митохондриях [2—5]. В митохондриях животных выделяют два основных механизма свободного окисления: 1) пассивную утечку протонов через
внутреннюю мембрану [3, 4]; 2) внутреннее разобщение комплексов дыхательной цепи [6]. В первом случае транспорт электронов комплексами дыхательной цепи митохондрий сопровождается запасанием энергии в виде разности электрохимических потенциалов ионов водорода на внутренней мембране митохондрий (Аря +), однако эта энергия не расходуется на синтез АТР, а рассеивается при возвращении протонов в мат-рикс [1—5]. Во втором случае электроны транспортируются по дыхательной цепи без векторного переноса протонов из матрикса в межмембранное пространство, т.е. без генерации ДД„+ [6].
Пассивная утечка протонов может быть усилена с помощью химических веществ, называемых протонофорными разобщителями окислительного фосфорилирования [3, 7]. Классические про-тонофорные разобщители — FCCP, 2,4-динитро-фенол (ДНФ) и др., увеличивая протонную проводимость внутренней мембраны митохондрий и рассеивая АДЯ+, стимулируют дыхание и снижают эффективность окислительного синтеза АТР (уменьшают коэффициент ADP/O) [3, 7, 8]. В отличие от этих разобщителей, взаимодействующих с протонами в объеме водной фазы, мембрано-тропные разобщители преимущественно взаимодействуют с фракцией протонов, связанных с внешней поверхностью внутренней мембраны митохондрий [9, 10]. Пассивная утечка протонов может быть усилена и с помощью свободных мо-нокарбоновых жирных кислот, которые можно рассматривать в качестве природных разобщителей окислительного фосфорилирования [3, 11, 12]. Установлено, что в митохондриях печени в условиях их инкубации без Са2+ в разобщающем действии монокарбоновых жирных кислот принимают участие белки-переносчики внутренней мембраны, осуществляющие обменный транспорт ADP на ATP (ADP/ATP-антипортер) и ас-партата на глутамат (аспартат/глутаматный антипортер) [3, 12, 13]. Участие этих белков в разобщающем действии жирных кислот заключается в переносе аниона жирной кислоты с внутреннего монослоя мембраны на наружный, где эти анионы протонируются и перемещаются в обратном направлении без участия белков по механизму флип-флоп, освобождая затем протоны в матрикс [3, 12]. Специфический ингибитор ADP/ATP-ан-типортера карбоксиатрактилат и субстраты ас-партат/глутаматного антипортера глутамат (или аспартат) аддитивно и независимо друг от друга ингибируют такое кальций-независимое разобщающее действие жирных кислот, т.е. проявляют ресопрягающий эффект [3, 12, 13]. В последние годы в качестве одного из перспективных направлений исследований рассматривается поиск разобщителей, направленных на митохондрии, и соединений, усиливающих разобщающее действие жирных кислот, с целью использования их в качестве потенциальных фармакологических средств [4, 10, 14-16].
Некоторые из общих и местных анестетиков способны стимулировать транспорт электронов по дыхательной цепи без снижения AT [17-19]. Предполагается, что механизм действия таких де-сопрягающих агентов (decouplers) заключается в переключении работы комплексов дыхательной цепи на холостой режим: так называемое внутреннее разобщение [6, 19]. Согласно альтернативной точке зрения стимуляция дыхания митохондрий без снижения мембранного потенциала, в
частности, одним из общих анестетиков — хлороформом, может определяться нарушением целостности внутренней мембраны в части этих ор-ганелл [20]. Позднее было установлено, что одна из длинноцепочечных а,ю-диоловых кислот — а, ю-тетрад екандиоловая (ТДК), в отсутствие Са2+ также способна стимулировать дыхание митохондрий печени, окисляющих сукцинат, без снижения мембранного потенциала [21, 22]. Такое десопрягающее действие ТДК обратимо и полностью устраняется циклоспорином А (ЦсА) в высокой концентрации (10 мкМ) [22]. Недавно нами было показано, что при аналогичных условиях 10 мкМ ЦсА также частично ингибирует стимулированное пальмитиновой кислотой дыхание митохондрий печени, но при этом не влияет на AT [23].
Можно предположить, что стимулированное ТДК и пальмитиновой кислотой ЦсА-чувстви-тельное Са2+-независимое свободное окисление в митохондриях печени, окисляющих сукцинат, осуществляется по одному и тому же механизму переключения работы комплексов дыхательной цепи на холостой режим. В процессе окисления сукцината в митохондриях электроны переносятся дыхательной цепи с сукцинатдегидрогеназы (комплекс II) последовательно на комплексы III и IV, которые одновременно с транспортом электронов осуществляют векторный перенос Н+ из матрикса в межмембранное пространство (генерация АДН+) [4, 24]. Дыхание интактных митохондрий, окисляющих сукцинат, в отсутствие синтеза АТР и разобщителей при высоком значении АДН+ (контролируемое состояние или состояние 2 по Чансу) лимитируется пассивной утечкой протонов и характеризуется низкой чувствительно -стью к ингибиторам дыхательной цепи в малых концентрациях [25]. При условии индукции неспецифической проницаемости внутренней мембраны в отсутствие АДН+ активность комплексов дыхательной цепи достигает максимального уровня, и в этом случае дыхание будет лимитироваться сукцинатдегидрогеназой как наиболее медленным этапом транспорта электронов [26]. Очевидно, что при переключении комплексов дыхательной цепи на холостой режим следует также ожидать изменения лимитирующей стадии дыхания с пассивной утечки протонов на сукци-натдегидрогеназу. Такое изменение можно определить с помощью ингибиторов этого фермента как усиление их действия в низких концентрациях на дыхание митохондрий [25, 26]. Конкурентным ингибитором сукцинатдегидрогеназы является мало-нат, широко применяющийся как инструмент при исследовании различных энергетических функций митохондрий [25, 27].
В настоящей работе изучено действие малона-та на дыхание митохондрий печени, стимулированное ТДК и пальмитиновой кислотой в отсутствие и в присутствии ЦсА в концентрации 10 мкМ. Ингибирующее действие малоната на активность ТДК сравнили с эффектом этого ингибитора на дыхание митохондрий, стимулированное в 2 раза БССР и до максимального уровня ДНФ. Особое внимание уделено влиянию малоната на ДТ при условии стимуляции дыхания митохондрий ТДК и БССР в 2 раза. Для ответа на вопрос, не связана ли стимуляция дыхания ТДК с индукцией у части популяции митохондрий неспецифической проницаемости внутренней мембраны, исследовали влияние этой кислоты на оптическую плотность суспензии митохондрий при различных условиях. Полученные результаты рассматриваются как свидетельство того, что индуцированное ТДК и пальмитиновой кислотой ЦсА-чувствительное дыхание митохондрий печени может быть обусловлено переключением части комплексов дыхательной цепи на режим переноса электронов с максимальной скоростью без векторного перемещения Н+ из матрикса в межмембранное пространство.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Митохондрии из печени самцов белых половозрелых крыс (весом 210—250 г) выделяли общепринятым методом дифференциального центрифугирования с последующим освобождением от эндогенных жирных кислот с помощью бычьего сывороточного альбумина (БСА) фракции V в соответствии с о
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.