БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2015, том 41, № 2, с. 212-217
УДК 547.979.733
МАРКЕР ДЛЯ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА НА ОСНОВЕ КОМПЛЕКСОВ ЕВРОПИЯ С ФТОРИРОВАННЫМ Р-ДИКЕТОНОМ РЯДА КАРБАЗОЛА
© 2015 г. Т. С. Кострюкова*, **, Н. П. Ивановская**, Г. В. Затонский **, Н. С. Осин**, Н. В. Васильев*, **, #
*ГОУВПО Московский государственный областной университет, Москва, ул. Радио, 10а
**ФГУП "Государственный научно-исследовательский институт биологического приборостроения", Москва Поступила в редакцию 12.05.2014 г. Принята к печати 03.07.2014 г.
С целью разработки новых маркеров для иммунофлуоресцентного анализа с временным разрешением люминесценции получен тетракетодиэфир ряда карбазола, содержащий метоксикарбониль-ные реакционноспособные группы, отделенные от хелатирующего 1,3-дикарбонильного фрагмента дифторметиленовыми спейсерами (CF2)4. Комплексы этого соединения с ионами Eu3+ устойчивы в водных растворах и обладают интенсивной длительно живущей (т 550—570 мкс) люминесценцией с основными максимумами: эмиссии — в области 615 нм и возбуждения — в области 380—390 нм, что отличает их от большинства применяемых аналогов. Получен конъюгат этого соединения со стреп-тавидином, люминесцентно-спектральные характеристики которого позволяют использовать его в качестве универсального реагента для различных схем биологического микроанализа.
Ключевые слова: люминесценция с временным разрешением, фторированные ft-дикетоны, комплексы европия, белки, конъюгаты, стрептавидин, биологический микроанализ.
DOI: 10.7868/S0132342315010091
ВВЕДЕНИЕ
Впервые длительно люминесцирующие комплексы фторированных Р-дикетонов с ионами лантаноидов (Еи3+, 8ш3+) стали использовать в лабораторной т уйго-диагностике в технологии метода диссоциативно усиленного лантанидного иммунофлуоресцентного иммуноанализа — ЭЕЕЕ1АМ в начале 80-х годов [1]. До настоящего времени этот метод удерживает свои лидирующие позиции в неонатальном скрининге наследственных болезней, в том числе и в России, где он применяется под названием ЫЕА (лантанидный иммунофлуо-ресцентный анализ) [2—4]. Успешность метода ЫЕА обусловлена стабильностью реагентов и хорошими характеристиками основного люминес-цирующего комплексона — 2-нафтоилтрифтора-цетона (МХА) (^возб 340 нм), обеспечивающего чувствительность и широкий диапазон выявляемых концентраций аналитов.
Сокращения: ЬША — лантанидный иммунофлуоресцент-ный анализ; МХА — 2-нафтоилтрифторацетон, ТОРО — триоктилфосфиноксид. #Автор для переписки (тел.: +7 (926) 344-78-37, эл. почта: nikolai-vasilev@mail.ru).
В последующие годы в развитие методов иммунофлуоресцентного анализа был создан ряд соединений, комплексы которых обладают улучшенными люминесцентными характеристиками, повышенными константами устойчивости, и, в некоторых случаях, реакционноспособными подшивочными группам [5—16]. Большинство из них не нашли применения в практике. На основе некоторых были разработаны новые диагностические методы с использованием реагентов: LANCE® [10-12], HTRF® [8] (комплексы Eu3+ на основе бис(нитрилодиуксусной кислоты) пиридина или терпиридина у реагентов LANCE или криптанда на основе трис(бипиридина) у реагента HTRF). Известна также технология ФОСФАН™, основанная на применении платиновых комплексов порфиринов, имеющих максимум возбуждения в полосе Соре 370-390 нм [17]. Тем не менее, проблема создания люминес-цирующих при достаточно длинноволновом возбуждении комплексов с высокими константами связывания ионов лантаноидов и включающих ре-акционноспособные группы для конъюгирования с биомолекулами является весьма актуальной при разработке мультиплексного анализа на основе микропланшетных чиповых технологий.
Среди соединений, которые могут рассматриваться в качестве кандидатов для получения эффективных маркеров биомолекул, обращают на себя внимание фторированные дикетоны и тетра-кетоны дибензоциклического [18], бензогетеро-циклического [19, 20] и дибензогетероцикличе-ского типов, в частности, карбазола (I) [21]. Основная эмиссия комплексов соединений ряда карбазола с Еи3+, также как и для других Р-дике-тонатных комплексов, сосредоточена на длине волны 615 нм (5Э0 ^ 7Б2-переход), однако максимум возбуждения, в отличие от НТА, находится в длинноволновой области 380-390 нм, для которой возможно использование дешевых светодиод-
213
ных источников света. Константа связывания Еи3+ с лигандом (I) не менее 10-12 М, что позволяет рассчитывать на получение маркера, пригодного как для твердофазного, так и для гомогенного анализа.
В настоящей работе предпринят синтез тетра-кетодиэфира ряда карбазола (II), содержащего метоксикарбонильные группы, отделенные от хе-латирующей части дифторметиленовыми спейсе-рами, осуществлена его конъюгация со стрептави-дином и изучены люминесцентно-спектральные характеристики комплексов с Еи3+ (см. схему).
О О
О О
БзС
СБ,
О
О
НзС
О О
СНз Л Л
+ Н3СО ДСР2)4 ОСН3
О О О
НзСО^(СР2)4
О О О
. Л
(СБ2)4 ОСНз
О О О
НзСО^(СР2)4
О О О
+ НзС^^(СБ2)4
О О О
те^ОН +
(III)
О О О
I ^^ОН
N
СНз (,У)
Схема. Взаимодействие диацетилкарбазола с диметилперфторадипинатом в присутствии гидрида натрия.
Отдельно приведена формула тетракетона карбазола (I).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Синтез маркера. Синтез дибензогетероцикли-ческих тетракетонов типа (I) по реакции Кляйзе-на с применением метилата натрия в качестве ка-
тализатора был описан в патенте [21]. Для получения тетракетодиэфира ряда карбазола (II) в качестве ацилирующего реагента мы использовали диметиловый эфир перфторадипиновой кислоты в 3—5 кратном избытке. Реакции проводили
214
КОСТРЮКОВА и др.
Рис. 1. Спектры поглощения соединения (II), NTA и их комплексов с Eu3+ в водных растворах: (1) —лиганд (II); (2) - (II) + Eu3+; (3) - (II) +Eu3+ + TOPO, (4) - лиганд NTA, (5) - NTA + Eu , (6) - NTA + Eu3+ + TOPO. Концентрации лигандов 10" 5 М, Eu3+ 6.67 x 10"6 М (в случае (II) и 3.3 x 10"6 М (в случае NTA), TOPO 5.10" 5М.
в среде сухого эфира, при этом оказалось, что применение метилата натрия для получения тет-ракетодиэфира (II) неэффективно, поскольку в его присутствии образуется большое количество неотделяемых при очистке побочных продуктов реакции. В присутствии гидрида натрия реакция заканчивается в течение 120 ч, однако в спектрах 1Н-ЯМР смеси продуктов реакции наблюдается существенное снижение интенсивности сигналов метокси-групп, удвоение интенсивности сигналов гетероароматического цикла и появление двух близко лежащих сигналов СН3-групп (4.02 м.д. и 4.05 м.д.) приблизительно одинаковой интенсивности. Состав полученной смеси устанавливали с помощью двумерной ЯМР-спектроско-пии с гетероядерной корреляцией HSQC 1Н-13С. Оказалось, что сигналы СН3-групп коррелируют с различными по химическому сдвигу ядрами 13С: 55 м.д и 30 м.д. соответственно. Химический сдвиг 55 м.д. характерен для 13С метоксигрупп -OCH3, в то же время химический сдвиг 30 м.д. соответствует 13С метильной группы у "пиррольно-го" азота конденсированных циклов NCH3. Таким
образом, в присутствии NaH происходит алкилиро-вание NH-группы карбазола с образованием наряду с тетракетодиэфиром (II) соединений (III) и (IV) (схема).
Более подробно была изучена конденсация в присутствии LiH. Оказалось, что реакция заканчивается за ~20 ч и выход продукта составляет 84%. Анализ индивидуальности полученного продукта методом ЯМР показал снижение количества СН3O-групп в сравнении с расчетным на ~5—10%, а образование продукта (IV) не зафиксировано. Данные 13С-ЯМР указывают на наличие только СН3О-групп.
Таким образом, при применении гидрида лития тетракетодиэфир (II) получен с высоким выходом и с удовлетворительным качеством, что позволило использовать его в последующих реакциях конъюгации с белком.
Комплексообразование и спектральные свойства. Синтезированный тетракетодиэфир (II), тетра-дентатен и, по-видимому, образует двуядерный комплекс с европием, как было показано в аналогичном случае в работе [23]. Комплексообразова-ние изучено люминесцентно-спектральным способом при соотношении лиганд—Eu3+ = 3 : 2 в присутствии избытка триоктилфосфиноксида (TOPO) в водной фазе. В качестве сравнения использовали коммерчески доступный бидентатный лиганд 2-нафтоилтрифторацетон (NTA), образующий при избытке TOPO комплекс лиганд—Eu3+ = 3 : 1 [1].
В спектре соединения (II) в водной среде (рН 7) наблюдаются два максимума поглощения: при ~330 и ~400 нм (рис. 1, кривая 1). Образование комплекса с Eu3+ проявляется в сближении этих максимумов и возрастании оптического поглощения. При введении синергиста, TOPO поглощение еще более увеличивается, спектр становится более структурированным и преобладающим становится максимум в области 395 нм (кривая 3 на рис. 1). При образовании комплекса NTA-Eu3+ 3 : 1 положение максимума поглощения ~340 нм практически не изменяется, его интенсивность наиболее заметно увеличивается в присутствии TOPO (кривые 4, 5 и 6 на рис. 1 соответственно).
Таблица 1. Люминесцентно-спектральные характеристики комплекса тетракетодиэфира (II) и NTA с Eu 0.05 М Трис-буфере, рН 7.2, в отсутствие и в присутствии Тритона Х-100
3+
Лиганд [Eu3+], мкМ ^возб, нм Inax х 103, отн. ед. т, мкс
(II) 2 340 ^ 340; 388 ^ 376 73.0 ^ 177.4; 96.7 ^ 236.3 440 ^ 558
(II) 3 340 ^ 340; 382 ^ 378 59.6 ^ 190.4; 79.3 ^ 253.2 440 ^ 574
NTA 1 340 31.9 ^ 243.2 183 ^ 714
Примечание. Концентрации лигандов 3 х 10-6 М, TOPO 5 х 10-5 М; ^ изменение люминесценции при введении 0.1% Тритона Х-100. Интенсивности люминесценции получены при Хэм 615 нм, td (время задержки измерения сигнала) 0.1 мс, tg (время регистрации сигнала) 1.0 мс.
в
Определенное влияние на люминесцентно-спектральные характеристики оказывает использование буферных растворов и наличие изолирующей оболочки ПАВ вокруг комплекса (табл. 1). Так, при рН 7.2 максимум поглощения соединения (II) и его комплексов с Еи3+ несколько сдвинут в коротковолновую область, и зависит от соотношения лиганд/ион. Включение комплексов в мицеллы Тритона Х-100 приводит к дополнительному гипсохромному сдвигу и более чем двукратному возрастанию интенсивности люминесценции, а также некоторому увеличению време
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.