ш
УДК 577.152.34'164.2.08:543.51
МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ АФФИННО-ОЧИЩЕННЫХ ПРОТЕАСОМ ИЗ КЛЕТОК МИЕЛОГЕННОЙ
ЛЕЙКЕМИИ ЧЕЛОВЕКА ЛИНИИ К562 © 2014 г. Т. О. Артамонова*, М. А. Ходорковский*, А. С. Цимоха**, #
*ФГБОУВПО Санкт-Петербургский Государственный Политехнический Университет **ФГБУНИнститут цитологии РАН, 194064, СанктПетербург, Тихорецкий пр., 4 Поступила в редакцию 19.05.2014 г. Принята к печати 11.06.2014 г.
Протеасомы осуществляют регулируемый протеолиз большинства белков в клетке и тем самым играют ключевую роль в регуляции различных клеточных процессов. Одним из важных этапов в понимании функций протеасом в клетке и механизмов их регуляции является определение субъединичного состава и посттрансляционных модификаций протеасом. Для решения этой задачи на примере клеток миелогенной лейкемии человека использована стратегия аффинной очистки протеасом с последующим масс-спектрометрическим анализом. Протеасомы очищали из стабильной клеточной линии К562, экс-прессирующей субъединицу Р7 (PSMB4) 20S протеасомы, меченную по С-концу HTBH-пептидом, включающим два фрагмента His6, специфический сайт расщепления Tobacco Etch Virus (ТБУ)-проте-азой и сигнальную последовательность для биотинилирования in vivo, методом нековалентного связывания — через образование комплекса биотина со стрептавидином с последующей элюцией посредством TEV-протеазы. С помощью MALDI-ICR-масс-спектрометрии идентифицированы все субъединицы 26S протеасомы, а также регуляторы PA200 и PA28y. Показано, что с протеасомами ассоциированы белки теплового шока, компоненты убиквитин-протеасомной системы и некоторые белки цитоскелета. Выявлен ряд новых сайтов фосфорилирования, убиквитинилирования и Ж-конце-вые модификации у 16 субъединиц протеасом. Представленный масс-спектрометрический анализ будет крайне полезен для дальнейших протеомных исследований протеасом при клеточном стрессе.
Ключевые слова: аффинная очистка, масс-спектрометрия, протеасома, клетки миелогенной лейкемии человека, убиквитин-протеасомная система, убиквитинилирование, фосфорилирование.
Б01: 10.7868/80132342314060049
ВВЕДЕНИЕ
В клетках эукариот, большая часть внутриклеточных белков расщепляется по убиквитин-проте-асомному пути [1]. Белок помечается полиубикви-тиновой цепочкой при участии целого каскада убиквитинилирующих ферментов и расщепляется затем 268 протеасомой до пептидов и отдельных мономеров убиквитина.
268 протеасома — это мультисубъединичный белковый комплекс массой примерно 2.5 МДа, который состоит из протеолитического ядра — 208 протеасомы и одного или двух регуляторов 198. 208 протеасома представляет собой полый цилиндр, состоящий из четырех сложенных в стопку гептамерных колец: два внешних кольца
Сокращения: AMC — 7-амино-4-метилкумарин; MALDI-ICR — масс-спектрометрия ионно-циклотронного резонанса с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией, TEV — Tobacco Etch Virus.
# Автор для связи (тел.: +7 (812) 297-37-40, факс: +7(812) 297-0341; эл. почта: atsimokha@mail.cytspb.rssi.ru).
образованы субъединицами а-типа, два внутренних кольца — субъединицами Р-типа [2]. У 208 протеасом клеток эукариот субъединицы а-типа отвечают за сборку 208 комплекса и формируют "ворота", через которые помеченный к деградации белок доставляется в протеолитическую камеру, а также обеспечивают взаимодействие 208 протеасомы с регуляторными комплексами и с другими белками, которые, согласно литературным данным, взаимодействуют с протеасомами в случае убиквитиннезависимого протеолиза [3, 4]. Предполагается также существование у субъединиц а-типа специфической эндорибонуклеазной активности [5]. Субъединицы Р-типа образуют центральные кольца и протеолитическую полость 208 протеасомы, где осуществляется протеолиз белка. Три из семи субъединиц Р-типа, Р1, Р2 и Р5, протеолитически активны по типу каспазы, трипсина и химотрипсина, соответственно. Воздействие у-интерферона стимулирует экспрессию трех дополнительных каталитических р-субъединиц (рИ/ЬМР2, р21/МБСЬ1 и р51/ЬМР7),
называемых иммунными, которые замещают соответствующие конститутивные Р-субъединицы, что в свою очередь приводит к изменению продуктов расщепления белкового субстрата — образованию иммуногенных пептидов, выставляемых на молекулах главного комплекса гистосовмести-мости класса I [6]. У позвоночных обнаружена дополнительная каталитически активная субъединица, названная Р5^ которая экспрессируется в кортикальных эпителиальных клетках тимуса и играет роль в селекции Т-киллеров [7].
Регуляторный комплекс протеасом 198 служит для узнавания полиубиквитинилированных белков и подготовки их к деградации в 208 протеасо-ме [8]. Комплекс 198 имеет молекулярную массу около 1 МДа и состоит из шести АТР-азных (ЯрИ—б) и из одиннадцати неАТР-азных (Ярп1—3, Ярп5—12) субъединиц. С развитием новых подходов к очистке и идентификации белков обнаружили новые белки протеасомного регулятора 198, но пока неясно, какую функцию они несут [9, 10].
208 протеасомы помимо регуляторной частицы 198 могут связывать и другие регуляторные комплексы: РА28 и РА200. Регуляторный комплекс РА28 а/Р с молекулярной массой около 200 кДа имеет структуру гетерогептамерного кольца и состоит из гомологичных субъединиц РА28а и РА28Р, которые индуцируются под действием у-интерферона [11]. Моногептамерный комплекс РА28у предположительно участвует в процессе деления клетки и в онкогенезе [12]. Регулятор РА200 состоит из одного белка с молекулярной массой 200 кДа и в комплексе с 208 протеасомой участвует в репарации ДНК [13]. Важно отметить, что 208 протеасо-ма, имея один регулятор 198, может связывать дополнительно РА28- или РА200-регулятор, формируя гибридную протеасому 198-208-РА28 или 198-208-РА200 [11, 14].
За счет деградации специфических регулятор-ных белков убиквитин-протеасомная система играет центральную роль в регуляции таких основных клеточных процессов, как клеточная диффе-ренцировка, транскрипция, репарация ДНК, прохождение клеточного цикла, пролиферация, иммунный и воспалительный ответы, апоптоз [2, 5]. Нарушения в убиквитин-протеасомной системе часто коррелируют с возникновением патологических событий, таких как опухолеобразование, метастазирование, воспалительные процессы, ней-родегенеративные заболевания [15], вследствие чего компоненты системы рассматриваются как фармацевтические мишени. Так, например, ингибитор протеасом Velcade (бортезомиб или Р8341) сегодня успешно используется в лечении онкологических больных [16]. Показано, что Vel-cade и подобные ему ингибиторы протеасом вызывают апоптоз в быстро пролиферирующих клетках, в то время как нормальные клетки не-
чувствительны или менее чувствительны к их действию [17]. Оказалось, однако, что регуляция апоптоза протеасомами более тонкая и комплексная и определяется, по-видимому, широким спектром клеточных процессов, протекающих с их участием.
Основными способами регуляции активностей протеасом, как известно, являются модуляция их состава в клетке и посттрансляционные модификации протеасомных белков [15]. Поэтому для понимания функций протеасом в клеточных процессах и способах их регуляции важно исследовать состав протеасом и посттрансляционные модификации протеасомных субъединиц. Несмотря на существование немалого количества протеомных исследований протеасом, стоит отметить, что, во-первых, большинство из них были сосредоточены на 20S протеасомах [18—20] и, во-вторых, многие из этих исследований были выполнены на протеасомах из дрожжей.
Ранее показано, что экспрессия в клетках человека линии HEK293 субъединицы 19S регулятора протеасом Rpn11 (PSMD14), слитой по С-концу с пептидом HTBH, включающим два фрагмента His6, специфический сайт расщепления TEV-проте-азой и сигнальную последовательность для био-тинилирования in vivo, позволяет быстро выделять протеасомы высокой степени очистки [21]. Мы полагаем, что выбор авторами этой субъединицы для мечения с целью аффинной очистки комплекса и последующего протеомного анализа не является оптимальным в силу ограничения в наборе субпопуляций протеасом: очищены будут лишь те субпопуляции протеасом, в составе которых присутствует комплекс 19S, исключая свободные 20S протеасомы и 20S протеасомы в комплексе с другими регуляторами (PA28, PA200). Кроме того, популяция очищенных протеасом будет содержать свободные комплексы 19S, которые, как известно, участвуют в регуляции транскрипции независимо от протеолитической функции протеасом [5].
В настоящей работе мы выбрали для мечения субъединицу Р7 (PSMB4) 20S протеасомы с целью аффинной очистки всех протеолитически активных субпопуляций протеасом из клеток миело-генной лейкемии человека линии К562. Для про-теомного анализа аффинно-очищенных протеасом использовали MALDI-ICR-масс-спектрометрию (масс-спектрометрию ионно-циклотронного резонанса с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для очистки протеасом из клеток человека линии К562, р7-субъединица 20S протеасомного комплекса была помечена по С-концу пептидом
StuI
(4873)
StuI
(3227)
MCS
(2241-2287)
Forward sequencing primer Reverse sequencing primer
(в)
K562 K562^7-HTBH
Hís6 TEV Biotin Hís6 I 12 3 4 --J 50 -
EagI
PacI EcoRI 35
ß7 (PSMB4)
HTBH
2240 2250 22б0 2270 2280 CGCGGCCGCACCGSTAGGCCTCGTACG CTTAArTAACGGATCCGGAATTCC
NotI AgeI PacI BamHI EcoRI
35 25
Rpn7
a7
ß7-HTBH(anti-biotin)
ß7-HTBH ß7
(б)
lM
19S
20S
Химотрипсин
(г)
Tрипсин
Каспаза
Рис. 1. Аффинная очистка протеасом из клеток K562, стабильно экспрессирующих меченый белок ß7-HTBH (K562/ß7-HTB). (а) Схематическое представление слитой конструкции ß7-HTBH [21], содержащей последовательности His6 (H), сайт для расщепления TEV-протеазой (T) сигнальную последовательность для биотинилирования in vivo (B). (б) Иммунохимическое выявление протеасомных антигенов в комплексе со стрептавидин-биотином после инкубации стрептавидинового носителя с клетками K562, контрольными и K562/ß7-HTBH. Денатурирующий электрофорез в 13% ПААГ 50 мкг клеточного экстракта из клеток К562 — контрольных (1) и K562/ß7-HTBH (3), и белков в комплексе со стрептавиди
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.