научная статья по теме МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ЦИТОХРОМОВ Р450 И ИХ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ Химия

Текст научной статьи на тему «МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ЦИТОХРОМОВ Р450 И ИХ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ»

ш

УДК 577.152.1462:543.51

МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ЦИТОХРОМОВ P450 И ИХ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ

© 2011 г. Н. Е. Москалева*, В. Г. Згода#, А. И. Арчаков

Учреждение РАМН Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН,

119121, Москва, ул. Погодинская, 10 Поступила в редакцию 07.07.2010 г. Принята к печати 12.08.2010 г.

Содержание отдельных представителей подсемейств 1A, 3A, 1E, 2C, 2D цитохромов Р450 измерено методом мониторинга множественных реакций (MRM — Multiple Reaction Monitoring) при помощи масс-спектрометра с тройным квадруполем. Методику разрабатывали и тестировали на образцах микросом печени мышей контрольной группы и после индукции фенобарбиталом или метилхолантреном. Применение данной методики позволило провести масс-спектрометрическое измерение содержания отдельных изоформ P450 без использования изотопных меток и специальных дериватизирующих реагентов. Результаты изменения содержания определенных изоформ P450 коррелировали с изменением ферментативной активности, определенной при помощи изоформспецифичных маркерных субстратов.

Ключевые слова: количественная протеомика; цитохромы Р450, определение содержания изоформ, безмет-ковый метод; масс-спектрометрия.

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время с развитием персонифицированной медицины все более актуальным становится изучение метаболизма различных ксенобиотиков, в частности лекарственных препаратов [1]. Известно, что печень является ключевым детоксицирующим органом и именно в ней происходит основная биотрансформация ксенобиотиков, причем основная роль в 1-й фазе принадлежит ферментам суперсемейства цитохромов Р450 (P450). P450 представляют собой гемсодержащие монооксигеназы и входят в состав микросомной монооксигеназной системы. Система локализована на мембранах эндоплазмати-ческого ретикулума и включает, кроме Р450, NADP-цитохром-Р450—редуктазу и цитохром Ь5 [2]. Последние два белка служат только для генерации и организации цепи передачи электронов [3]. Активность и специфичность монооксигеназной системы определяется главным образом содержанием различных изоформ цитохрома Р450. В метаболизме лекарственных средств у человека, в основном, принимают участие изоферменты семейств I, II и III, в частности, почти 90% реакций гидроксилирования лекарств и ксенобиотиков катализируются изофор-мами CYP3A4, CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 [3].

Сокращения: MRM — мониторинг множественных реакций; CYP, P450 — суперсемейство цитохромов Р450; QTOF — вре-мяпролетный масс-спектрометр с квадруполем; QqQ — хро-матомасс-спектрометр с тройным квадруполем. #Авторы для связи (тел.: (499) 246-84-65; эл. почта: nemoskale-va@gmail.com; vic_zgoda@yahoo.com).

Различные химические соединения могут влиять на активность монооксигеназной системы, как повышая ее (индукция), так и снижая (ингибирова-ние). Наиболее известными индукторами цитохрома являются метилхолантрен и фенобарбитал, причем метилхолантрен индуцирует в основном изоформы CYP1A1, 2 и CYP1B1, а фенобарбитал — CYP2B6, CYP3A4 [4]. В настоящее время растет интерес к изучению взаимосвязи между количественным содержанием отдельных изоформ цитохромов и их активностью как в in vivo-, так и в in vitro-системах.

Для измерения ферментативной активности белка скорость реакции рассчитывается по количеству образующегося метаболита при взаимодействии P450 с маркерным для данной изоформы субстратом. Согласно литературным данным, выделяют методы анализа, основанные на ВЭЖХ с УФ- или масс-спектрометрическим детектированием, измерении радиоактивности, флуоресценции или люминесценции [4—9]. Наиболее простыми и быстрыми являются флуоресцентные методы. Однако их ограничениями является низкая изоформспецифич-ность используемых субстратов, поэтому их используют в основном на рекомбинантных "чистых" ферментах [4, 5, 9]. В настоящее время большое распространение получили методы, основанные на масс-спектрометрическом детектировании образующихся метаболитов. Использование данных методик одобрено Управлением по продуктам и лекарствам США (FDA) для ранних доклинических исследований при разработке новых лекарств [10, 11]. Причем, в качестве субстратов используются лекарственные вещества, селективно метаболизируемые

изоформами цитохрома P450. Изоформспецифич-ные субстраты дают возможность оценить активность исследуемых ферментов в сложных системах, при этом в качестве объектов используются не только рекомбинантные ферменты, но и микросомы, ге-патоциты, клеточные линии и срезы тканей [12—18].

Количественное определение конкретной изо-формы цитохрома Р450 является более трудной задачей. Наиболее простой метод определения общего количества P450 — дифференциальная спектроскопия [19, 20], позволяющая измерить суммарное содержание всех изоформ цитохромов Р450, но требующая достаточно большого количества образца [19]. Применение количественного анализа мРНК для оценки экспрессии фермента также не достаточно информативно, так как содержание белка регулируется посттранскрипционными и трансляционными механизмами, а корреляции между уровнем мРНК и соответствующего белка невысоки [21, 22].

Более точными методами количественного анализа цитохромов Р450 являются иммунологические подходы, такие, как ELISA или Вестерн-блот, которые основаны на использовании специфических антител. Однако изоформспецифичное определение в этом случае затруднено высокой степенью гомологии между белками внутри семейств цитохро-мов Р450, а используемые антитела часто обнаруживают перекрестную специфичность, искажающую результат анализа. Кроме того, данный метод требует наличия высокоочищенного белка для калибровки, который не всегда доступен [23—25].

Наиболее перспективными являются методы, основанные на масс-спектрометрическом определении, которые позволяют селективно детектировать протеотипические пептиды (пептиды, которые при масс-спектрометрическом анализе характеризуют присутствие конкретного белка) в биологических образцах [25—27]. Существуют различные подходы к относительному и абсолютному количественному анализу белков при помощи масс-спек-трометрии, применимые для анализа цитохромов Р450. Так, наиболее распространенными являются методы анализа, основанные на присутствии изотопных меток. Стабильные изотопные метки могут быть введены методом химической дериватизации активных аминокислот, таких, как Cys или Lys, при помощи ацилирования или с использованием коммерческих наборов ICAT (Isotope-Coded Affinity Tag) и iTRAQ (Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation). Также стабильные изотопы вносятся в ходе синтеза белка при культивировании клеток в среде, содержащей изобарно-меченные аминокислоты, — метод SILAC (Stable isotope labeling with amino acids in cell culture) [28, 29].

При абсолютном количественном анализе белков используют изотопно-меченные пептиды, полученные путем химического синтеза в рамках стратегии AQUA (absolute quantification) [30]. Однако,

несмотря на то, что использование изотопно-меченных внутренних стандартов увеличивает воспроизводимость результатов анализа, это значительно удорожает и увеличивает время исследования. Так, использование изотопно-меченных реагентов требует присутствия в пептиде определенных аминокислот, что, в совокупности с высокой гомологией между цитохромами, затрудняет определение отдельных изоформ. Поэтому развитие методик относительного и абсолютного количественного анализа без использования изотопной метки в настоящее время является актуальным.

Цель данной работы — определение относительного количественного содержания изоформ CYP1A1, CYP1A2; CYP2E1; CYP3A11, CYP3A16, CYP3A41; CYP2C29, CYP2C39, CYP2C37, CYP2D9, CYP2D10 и исследование их активности методом мониторинга множественных реакций (MRM) при помощи масс-спектрометра с тройным квадрупо-лем в микросомах печени мышей контрольной группы и после индукции фенобарбиталом или метилхолантреном.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Хроматомасс-спектрометрический количественный анализ изоформ цитохромов подсемейств 1А, 2E, ЗА, 2C и 2D

Согласно литературным данным, хроматомасс-спектрометр с тройным квадруполем (QqQ — Triple quadrupole mass spectrometer) в режиме MRM имеет наиболее устойчивую воспроизводимость для относительного и абсолютного количественного анализа [31]. Данный тип приборов широко используется для анализа низкомолекулярных соединений в сложных матрицах в клинической практике, следовательно, перспектива использования MRM-режи-ма тройного квадруполя является очень привлекательной для количественной протеомики. Однако для разработки метода целевого MRM-анализа исследуемых изоформ цитохромов первым этапом является общий протеомный анализ микросом печени при помощи квадрупольного времяпролетного масс-спектрометра (QTOF — Quadrupole time-offlight mass spectrometer). Цель данного анализа — определение времен удерживания, m/z пептидов цитохромов Р450 и их фрагментов, полученных в ходе MS/MS-анализа.

В результате анализа при помощи QTOF были выявлены характерные триптические пептиды изо-форм Р450 CYP2E1, CYP1A1, CYP1A2, CYP3A5, CYP2C29, CYP2C37, CYP2C39, CYP2D9, CYP2D10 и при помощи программного обеспечения Spec-trumMill проверена их протеотипичность. Это позволило доказать, что выбранные пептиды обладают уникальными последовательностями как минимум в пределах протеома мыши. Последовательности части пептидов совпадали также с цитохромами чело-

Таблица 1. Протеотипические пептиды, обнаруженные для цитохромов подсемейств CYP2E, CYP1A, CYP3A, CYP2C и CYP2D при масс-спектрометрическом анализе и использованные для разработки методики количественного определения

Изоформы CYP Выбранный пептид Время удерживания*, мин Масса пептида, а.е.

1А1,2 IGSTPVVVLSGLNTIK 34.4 1597.9

1А1,2 SMTFNPDSGPVWAAR 28.1 1635.8

1А2 DFVENVTSGNAVDFFPVLR 45.5 2126.1

2Е1 MNMPYMDAVVHEIQR 35.6 1833.8

2Е1 FINLVPSNLPHEATR 28.2 1707.9

2Е1 DIDLSPVTIGFGSIPR 40.1 1686.9

3А11,16 FALMNMK 21.8 854.4

3А11,41 QGLLQPEKPIVLK 23.1 1462.8

3А11,41 ALLSPTFTSGK 20.4 1121.6

2C29,39 DFIDYYLIK 34.8 1189.6

2С29,37,54,50 SDYFMPFSTGK 27.9 1279.6

2C29 GTTVITSLSSVLHDSK

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком