АГРОХИМИЯ, 2007, № 9, с. 75-79
^=МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ =
УДК 543.544.45:543.51:633.854.78
МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОРТОВЫХ ПРИЗНАКОВ ПОДСОЛНЕЧНИКА
© 2007 г. Е. К. Барнашова, Ю. В. Лобачев, М. Г. Воронков, Е. Б. Белоусов
Саратовский государственный аграрный университет им. НИ. Вавилова 410012 Саратов, Театральная пл., 1, Россия E-mail: bio@ssau.saratov.ru Поступила в редакцию 14.12.2006 г.
Разработана методика хромато-масс-спектрометрического определения сортовых особенностей подсолнечника, позволяющая выявить характеристичные химические соединения в экстрактах язычковых лепестков. Химический состав экстрактов из язычковых лепестков пяти моногенных линий подсолнечника, отличающихся по цвету язычковых цветков, свидетельствует, что за каждый цвет отвечают характеристичные индивидуальные соединения.
ВВЕДЕНИЕ
Подсолнечник относится к наиболее значимым сельскохозяйственным культурам, возделываемым в средней полосе и южных районах России. Последние годы характеризовались снижением урожайности подсолнечника практически во всех регионах, что является следствием нарушения научно обоснованных севооборотов, а также может объясняться рядом других причин. Возможности повышения урожайности этой культуры связаны с возделыванием вместо сортов-популяций более технологичных гетерозисных гибридов, устойчивых к экстремальным условиям среды и обладающих высоким качеством семян. К числу новых приемов, обеспечивающих выращивание гибридных семян с высокой генетической чистотой, относится генетическое маркирование родительских линий и гибридов. В качестве маркерных могут быть использованы гены, контролирующие морфологические признаки, в частности различную окраску язычковых цветков [1]. Значительным препятствием при развитии настоящего направления является отсутствие доступных и надежных методов анализа генетических признаков отдельных сортов подсолнечника.
Известно, что цветовые характеристики природного растительного материала могут определяться наличием ряда химических соединений, наиболее значимыми из которых являются фла-воноиды [2], хиноны [3], кумарины [4], а также пигменты [5, 6]: тараксантин, лютеин, виолаксан-тин, криптоксантин, ацетоселлин и др. Флавоно-вые соединения в природном материале растительного происхождения, как правило, в свободном виде не встречаются. Они присутствуют в виде агликонов [7], антоцианов [8], в гликозиди-рованной [9, 10] или ацилированной [11] формах. Кумариновые производные склонны к образованию
гликозидированных антоциановых форм [12, 13], отвечающих за окраску природного растительного материала. Пигменты также не встречаются в свободном виде, а лишь в виде сочетаний с насыщенными жирными кислотами: стеариновой, пальмитиновой, миристиновой, лауриновой.
Очевидно, что анализ соединений, ответственных за цветовую гамму природного материала, является сложной задачей, требующей разработки специальной методологии [14, 15] и привлечения сложной аналитической аппаратуры [16, 17] либо целого комплекса аналитических средств [18].
Для решения аналогичных задач широкое распространение получили инструментальные методы анализа органических соединений, в частности хромато-масс-спектрометрия с ионизацией электронным ударом [19]. Индивидуальность спектральных характеристик анализируемых веществ в сочетании с высокой чувствительностью метода делают его одним из наиболее перспективных при идентификации сложных соединений и установлении состава многокомпонентных образцов, в том числе составов растительного происхождения [20].
Цель настоящего исследования - разработка экспресс-методики определения отличительных признаков изогенных линий подсолнечника по различной окраске язычковых цветков, приемлемой для использования в период вегетации растений.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования явились почти изоген-ные моногенные линии подсолнечника, с рецессивными аллелями генов 1,1а, о, ра, контролирующими разную окраску язычковых цветков: желтые &), лимонные (/), оранжевые (о), бело-желтые (1а), желто-зеленые (ра).
Семена каждого варианта изучаемых линий высевали вручную квадратно-гнездовым способом по типу конкурсного сортоиспытания, в трехкратной повторности, в шестирядных делянках площадью 70-80 м2. Сбор язычковых лепестков подсолнечника производили в период максимальной интенсивности цветения растений.
Для исследований использовали свежесобранные язычковые лепестки подсолнечника. Экстракты готовили в течение 10 ч после сбора растительного материала. В отдельных случаях свежесобранные лепестки в герметичной таре из темного стекла хранили в холодильной установке при 2-4°С до 10 сут.
Пробу свежесобранных язычковых лепестков массой 3 г тщательно механически измельчали и помещали в пробирку объемом 15 мл с притертой пробкой и заливали 5 мл экстрагента (эфир, метанол, бензол) марки ч.д.а. Закрытую пробирку выдерживали при комнатной температуре в течение 5 ч, периодически встряхивая. Затем пробирку помещали в ультразвуковую ванну фирмы Retsch (Германия), заполненную водой комнатной температуры, и воздействовали ультразвуком частотой 20 кГц в течение 4 ч. Пробирку вынимали из ванны и оставляли в вертикальном положении в покое на 30 мин. Из пробирки отбирали 2 мл экстракта, не содержащего растительного материала. Пробу упаривали в токе азота до получения 0.4 мл концентрированного раствора, который анализировали методом хромато-масс-спектро-метрии. Полученные таким путем пробы хранили сроком до 1-го мес. в герметичной стеклянной таре при температуре 2-4°С.
Состав экстрактов язычковых лепестков подсолнечника устанавливали методом хромато-масс-спектрометрии путем предварительного хроматографического разделения экстракта с последующей регистрацией разделенных компонентов масс-спектральным детектором в режиме полного сканирования. Объем вводимой пробы составлял 1 мкл.
Анализ образцов экстрактов язычковых лепестков подсолнечника осуществляли на хромато-масс-спектральном комплексе "MS-25RF" фирмы "Kratos". На первой стадии анализа производили разделение компонентов, входящих в состав пробы, с использованием колоночной газо-жидкост-ной хроматографии. Хроматографическое разделение компонентов исследуемого экстракта проводили на кварцевой капиллярной колонке DB-5 длиной 60 м, с неподвижной жидкой фазой SE-54, производства J&W фирмы "Scientific" (США).
Типовую настройку хроматографа производили в следующем режиме: начальная температура колонки - 40°С; время выдержки - 6 мин; скорость подъема температуры колонки - 10°С/мин; конечная температура колонки - 300°С; время
выдержки - 10 мин; температура инжектора -280°С; температура интерфейса - 280°С; давление на инжекторе - 1 атм; скорость потока газа-носителя (гелия) в колонке - 1 мл/мин; деление потока гелия в инжекторе - 1 : 10.
Стандартный режим работы масс-спектрометра имел следующие характеристики: температура источника ионов - 200°С; фактическая энергия ионизации - 70 Эв; номинальное значение вакуума в зоне источника ионов - 1 х 10-5 мм ртутного столба; температура квадруполя - 200°С; ток эмиссии электронов - 300 мкА; диапазон полного сканирования массовых чисел - 35.. .600 а.е. массы.
После прохождения хроматографической колонки разделенная паро-газовая смесь направлялась в камеру детектора-катарометра. Выходящий с детектора сигнал обрабатывался в типовом интеграторе и выводился на самописец. Таким образом, выходная кривая представляла собой ряд отдельных пиков, соответствующих индивидуальным химическим веществам, обнаруженным в экстракте.
Масс-спектрометрическая идентификация индивидуальных веществ позволила установить их молекулярную массу и строение. Для этого разделенная паро-газовая смесь, поступающая из хроматографического блока аналитического комплекса, направлялась в камеру ионизации масс-спектрометра. Интенсивность пиков оценивалась в процентах по отношению к общей величине ионного тока.
После прохождения хроматографа каждая из фракций смеси, соответствующая индивидуальному химическому соединению, направлялась в камеру ионизации масс-спектрометра. Индивидуальные соединения идентифицировались сравнением масс образующихся при электронном ударе ионов с данными библиотечных каталогов масс-спектров Willey 275, NBS-75 и NIST 98. При степени совпадения более чем на 90% индивидуальность и природа данного соединения считались установленными. Так, например, был идентифицирован 6-ацетил-2,5-дигидрокси-1,4-нафтохинон.
Выходной сигнал обрабатывался на стандартном аппаратурно-аналитическом комплексе масс-спектрометра и регистрировался в виде масс-спектров индивидуальных соединений.
На рисунке масс-спектр индивидуального соединения, зарегистрированного в эфирном экстракте желтых ф) лепестков подсолнечника, сравнивается с масс-спектром из каталога масс-спектров NIST 98.
Статистическая оценка характеристичных пиков свидетельствовала о высокой вероятности соответствия конкретного спектра каталожной выборке.
43
69
79
189
95 108 119 133 _ 163 ^^ ,
133 147 nil, 176, ,1
217
204
232
МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОРТОВЫХ ПРИЗНАКОВ Abundance
9000 b Average of 32.192 to 32.192 min.: 15J_EF2. D(-)
8000 7000
6000 L (а)
5000 4000 3000 2000
1000 Ь 53 0
9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0
217
43
#30275: 1, 4-Naphthoquinone, 6-acetyl-2, 5-dihydroxy-
(6)
189
69
53
133
78 91 105 119 I 143 161 176 .........„ml,_i, I i_Ll_i In i ,_i_iL_1,1
232
30 50 70 90 110 130 150 170 190 210 230
m/z
Масс-спектры индивидуального соединения: (а) - из реальной пробы эфирного экстракта желтых (я/) язычковых лепестков подсолнечника; (б) - из базы данных библиотечного каталога №БТ 98.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Установлено, что хроматограммы всех образцов содержали значительное количество пиков с массой от 80 до 90, соответствующих индивидуальным химическим соединениям.
При расшифровке состава образцов были идентифицированы от 85 до 95% индивидуальных соединений, зарегистрированных в результате хроматографического разделения проб экстра-гентов. Во всех лепестках независимо от генотипа подсолнечника присутствовали углеводороды (алканы, ал
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.