РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2009, ТОМ 3(12), № 1, с. 13-22
== ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ ==
МАТЕМАТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ АНАЛИЗА ПРОЛИФЕРАЦИИ Т-ЛИМФОЦИТОВ ПО ДАННЫМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОФЛУОРИМЕТРИИ
© 2009 г. Г.А. Бочаров1, Т.Б. Лузянина2, Дирк Розе3
1Институт вычислительной математики РАН, Москва, Россия;
2Институт математических проблем биологии РАН, г. Пущино, Россия;
3Отделение информатики, Католический университет, г. Лёвен, Бельгия Поступила: 25.11.08 г. Принята: 02.02.09 г.
В данной работе излагается математическая технология анализа кинетики пролифера-тивной активности Т-клеток крови человека с использованием флуоресцентного красителя СББЕ. Для её построения применяется минимальный математический аппарат в виде модели популяционной динамики клеток, проделавших разное число делений, и стандартные алгоритмы решения обыкновенных дифференциальных уравнений и конечномерной оптимизации в системе МЛТЬЛБ. По данным проточной цитометрии в форме распределений клеток по числу проделанных делений (поколений клеток) были идентифицированы кинетические параметры (скорости деления и апоптоза), характеризующие пролифера-тивный статус Т-клеток. Показано, что времена деления и полужизни клеток существенно зависят от количества завершенных митозов. При этом, в ходе иммунного ответа на ФГА, время деления Т-лимфоцитов уменьшается от 53 часов (наивные клетки) до 13 часов (клетки, совершившие 2 митоза), а время полужизни сокращается до 26 часов у клеток, проделавших 5 делений. Дается замкнутое исследование ключевых проблем (оценка точности параметров, качества математического описания), возникающих при решении задачи более глубокого извлечения информации из данных стандартных гистограмм распределений клеток по уровню содержания СББЕ.
Ключевые слова: математическое моделирование, пролиферация клеток, идентификация, проточная цитометрия
ВВЕДЕНИЕ
Современный этап развития иммунологии характеризуется широким применением высокопроизводительных методов многопараметрического анализа гетерогенных клеточных популяций с использованием флуоресцентных красителей и проточной цитометрии [1 — 4]. Генерируемая информация в виде одно-, дву- или многомерных распределений клеток по уровню экспрессии поверхностных клеточных маркеров (например, СБ4, СБ8), внутриклеточных цитокинов (интерферон-с, интерлейкин-4 и др.), флуоресцентных красителей используется для сортировки и разделения исходной популяции на однородные по некоторому выбранному признаку субпопуляции клеток в рамках
Адрес: 119333, г. Москва, ул. Губкина, 8; Институт вычислительной математики. E-mail: bocharov@inm.ras.ru
статического дескриптивного анализа. Так, для оценивания пролиферативного статуса лимфоцитов человека используется сукци-нилимидный эфир карбоксифлюоресцеина (СББЕ), и по разведению метки определяется число митозов, проделанных клетками [5]. Однако подобные данные наблюдений содержат также более фундаментальную информацию о временной динамике процессов деления, позволяющую идентифицировать индивидуальные характеристики клеточной кинетики, такие как, например, скорости пролиферации и гибели лимфоцитов в ходе иммунного ответа, с учетом возраста клеток [6]. Извлечение информации такого типа возможно лишь с применением математических технологий решения, так называемых, обратных задач, связанных с определением свойств явления по его наблюдаемым проявлениям. Процедура решения основывается на применении существующих методов вычислительной математики. Целью настоящей работы являются:
200 г
х 105
150-
100-
50-
—I I I I I 11 1
^ ' День 5
День 6
V
—I I I 1111—
1 I О
День 5
101 102 Интенсивность CFSE
101 102 Интенсивность CFSE
Рис. 1. СБЯЕ гистограммы, представляющие распределение сигналов (а) и числа клеток (б), измеренные с 3 по 7 сутки (линии являются линейной интерполяцией дискретных данных) после начала эксперимента. Вертикальные линии вверху показывают интервалы интенсивности СБЯЕ, соответствующие последовательным поколениям клеток
(1) решение задачи идентификации характерных времен деления и жизни клеток на примере данных пролиферативных экспериментов in vitro с использованием мононуклеаров, выделенных из периферической крови человека, меченых CFSE и стимулированных ФГА, и (2) изложение алгоритма идентификации с использованием стандартных методов пакета программного обеспечения MATLAB.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Данные по пролиферации клеток. Нами рассматривались результаты стандартных, по методике проведения, экспериментов по изучению пролиферации Т-лимфоцитов человека, полученных из периферической крови и стимулированных in vitro фитогемагглютинином (ФГА) [7]. Популяция клеток, окрашенных флуоресцентным красителем CFSE, анализировалась с помощью проточной цитометрии. Клетки инкубировались с моноклональны-
ми антителами к поверхностным клеточным антигенам CD4 и CD8. Пролиферационную активность Т-лимфоцитов оценивали по снижению уровня флуоресценции CFSE. Типичный вид гистограммы относительного распределения Т-клеток по экспрессии CFSE представлен на рис. 1а. Общее число клеток в культуре, зависящее от интенсивности процессов деления и апоптоза, оценивалось визуально, с помощью микроскопа. Знание общей численности популяций клеток позволяет получить гистограммы абсолютного распределения Т-клеток по содержанию CFSE, рис. 1б. С помощью стандартного программного обеспечения (ModFit, CellQuest, FlowJo) можно осуществить декомпозицию гистограммы распределения Т-клеток по экспрессии CFSE на последовательные фрагменты, соответствующие поколениям Т-клеток, проделавших различное число делений. Измерения проводились ежедневно с 3 по 7 сутки после начала стимуляции. Кинетика распределения
Таблица 1. Общее число живых, Ni, и мертвых, D', лимфоцитов и распределение лимфоцитов соответственно числу проделанных делений, Nj, j = 0, 1, ..., 7, были измерены с 3-го по 7-й дни эксперимента в указанные моменты времени ti, i = 0, 1, ..., 4
время (дни) (ti)4=o число живых клеток Ni число мертвых клеток Di число клеток Nj, поделившихся j раз, j = 0, 1, 2, ..., 7
0 1 2 3 4 5 6 7
3 1,4 х 105 1,6 х 104 29358 22876 43372 39970 5208 98 14 0
4 2,5 х 105 2,4 х 104 16050 12600 22650 57025 96350 46950 2500 25
5 4,4 х 105 6,0 х 104 14476 14784 25344 58652 141460 156290 32076 440
6 5,0 х 105 1,2 х 105 13500 12150 24150 55000 137850 188950 69450 2150
7 5,7 х 105 1,3 х 105 13509 12198 21603 51927 140560 232160 96102 3420
Число делений => Номер поколения 0 12 3
б)
Хо
деление
Хо/2 Хо/22
деление
Хо/27
деление
апоптоз
апоптоз
Б - мертвые (не дезинтегрированные) клетки
^ дезинтеграция
Рис. 2. Биологическая схема математической модели деления Т-лимфоцитов, меченых СРЯБ. а) Популяция делящихся клеток, окрашенных СРЯБ, гетерогенная по содержанию красителя на клетку. Средний уровень СРЯБ на клетку определяется номером поколения и принимает значения Х0/2//, где/ — число проделанных делений. б) Популяции клеток и элементарные процессы, рассматриваемые в модели
популяции Т-клеток, гетерогенной по числу проделанных делений, характеризуется данными таблицы 1. Доля погибших, но не дезинтегрированных клеток оценивалась с помощью бензидинового красителя «трипановый синий».
Перейдем к решению задачи идентификации скоростей деления/апоптоза Т-лимфоцитов в зависимости от числа проделанных делений.
Математическая модель клеточного деления. Количественное изучение параметров процессов в иммунной системе связано с построением некоторой математической моде-
ли или семейства моделей, связывающих анализируемый процесс с его экспериментально наблюдаемыми характеристиками. Биологическая схема процессов, которые учтены в модели, представлена на рис. 2. При изучении Т-клеточной пролиферации с использованием СРЯБ количественно измеряемыми величинами является общий размер популяции клеток, гетерогенной по числу проделанных делений, которое будем обозначать индексом /, а также численность клеток в каждом поколении N (рис. 2а). Заметим, что вследствие уменьшения количества красителя СРЯБ в дочерних клетках в 2 раза при каждом делении,
максимальное число доступных наблюдению клеточных делений (последовательных поколений клеток) не превышает J =8 -н 10, т.е. j = 0, 1, ..., J. Таким образом, в модели клеточного деления в качестве непрерывно зависящих от времени (t) характеристик рассматривается количество клеток Nj(t), проделавших j делений. Кроме того, имеются данные по общему числу погибших, но не дезинтегрированных клеток D(t). Изменение численности этих клеточных популяций определяется действием двух процессов — пролиферации и апоптоза (рис. 2б). Математическое описание клеточной кинетики возможно с разной степенью биологической детализации и с использованием различных математических подходов (типов уравнений, функциональных зависимостей) [8—11].
Для целей нашего анализа мы воспользуемся моделью, аналогичной модели клеточного деления, предложенной Kendall [12]. Данная модель относится к категории неструктурированных математических моделей, в которых учитывается гетерогенность клеточной популяции по некоторому признаку, в нашем случае — числу проделанных делений. Уравнения математической модели описывают скорость изменения численности клеток, линейно зависящую от размеров соответствующих популяций и кинетических параметров — констант скоростей деления и гибели клеток oj и bj, соответственно, а также скорости дезинтеграции клеток 8:
dtNo(t)
-(a+bo) $ No(t),
d-tNj(t) = 2 ■ a-1 ■ Nj-i (t)-(aj + bj) ■ Nj(t),
j = 1,2.....J,
раметрической идентификации. Поскольку данные наблюдений по своей природе содержат случайные погрешности, для решения такого рода обратной задачи воспользуемся методами теории статистического оценивания неизвестных параметров [13, 14]. В качестве критерия согласия модели и данных наблюдений выберем функцию правдоподобия l({NJ,D'YjZ071 p), которая определяет вероятность получения конкретных результатов наблюдений |N',D', t^'_04 в зависимости от значений вектора параметров модели p = [a0, a1, ..., a7, b0, 31, ..., 37, 8]. Соответственно, число параметров в данной модели
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.