БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 3, с. 583-588
БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ =
УДК 57.013
МАТЕРИАЛ НА ОСНОВЕ КОЛЛАГЕНА И ТАКСИФОЛИНА:
ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙ СТВА
© 2015 г. Ю.В. Шаталин* **, В.С. Шубина* **
*Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН,
142290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 3; **Пущинский государственный естественно-научный институт, 142290, Пущино Московской области, просп. Науки, 3 E-mail: yury.shatalin@yandex.ru Поступила в p едакцию 16.03.15 г.
Изучена возможность получения материала на основе коллагена и биологически активного полифенола - таксифолина и исследованы его свойства. Получены данные по динамике высвобождения полифенола, химически связанного с коллагеном, и определена его металл-воостанавливающая активность. Изучено действие таксифолина, глутарата таксифолина и геля, содержащего полифенол, на продукцию активных форм кислорода нейтрофилами, стимулированными форбол-миристат-ацетатом. Показано наличие антиоксидантных и металл-восстанавливающих свойств полифенола, высвобождаемого из гелевого материала, что свидетельствует об эффективном включении неокисленной формы полифенола в состав коллаге-нового геля.
Ключевые слова: таксифолин, коллаген, динамика высвобождения полифенола, антиоксидантная активность, металлвосстанавливающая активность.
Регенерация тканей - это один из самых сложных процессов в организме, который про -текает на протяжении всей жизни человека. Повреждение ор ганов и тканей могут вызывать как внешние воздействия (р езультатом которых являются ранения, переломы, ожоговые травмы и др.), так и внутренние заболевания о рганизма, число которых увеличивается с возрастом. На данный момент существуют многочисленные тканеинженерные материалы, каждый из которых обладает своими пр еимуществами и недостатками. Широкое распространение получили материалы на основе биодеградабельных полимеров, таких как коллаген и коллаген-подобные белки и пептиды. Препараты на основе данных полимеров, в том числе самого коллагена, применяются для гемостаза, регенерации мягких тканей, в качестве искусственной кожи при ра -невых и ожоговых травмах кожи, для регенерации костной ткани и доставки биологически активных веществ [1-3]. В связи с тем, что коллаген представляет собой основной белок соединительной ткани, в тканях присутствуют фер менты, способные расщеплять данный белок
Сокращения: ФМА - форбол-12-миристат-13-ацетат, DMTMM - 4-(4,6-димитокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метил-морфолин хлорид, АФК - активные формы кислорода, ЛХЛ - люминолзависимая хемилюминесценция.
и препараты, полученные на его основе. Для уменьшения скорости дегр адации таких препа -ратов их дополнительно модифицируют, формируя поперечные сшивки, используя так называемые кросссшивающие агенты, например токсичный глутаровый альдегид. Мы полагаем, что использование функционализированных природных полифенолов, в качестве кр осссши-вающих агентов, позволит получить нетоксичный материал, в процессе деградации которого в окружающую ткань будет высвобождаться биологически активное вещество - полифенол. С уществуют многочисленные свидетельства того, что полифенолы являются эффективными антиоксидантами и демонстрируют разнообразные биологические эффекты, включая антибактериальное, противовирусное, противоопухолевое и противовоспалительное действие [4]. Полифенолы оказывают ранозаживляющее действие после термических [5] и химических ожогов [6,7], уменьшают фиброзное образование ткани [8], а также усиливают регенарационные про -цессы в патологических условиях, например при сахарном диабете I типа [9]. Кроме того, полифенолы способны формир овать связи с гид-роксильными, карбоксильными, карбонильными, амино- и тиольными группами белков, что свидетельствует о возможности получения новых материалов на основе только природных
компонентов. В частности, соединения полифе-нольной природы могут выступать в качестве кросссшивающих агентов и соединений, стабилизирующих структуру материала [10-12]. Целью данного исследования являлось изучение возможности получения материала на основе коллагена и биологически активного полифенола - таксифолина и изучение свойств полученного материала.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использованы: таксифолин (НПФ «Фламена», Россия); сульфат железа (II), хлорид железа (III), ацетат натрия, уксусная кислота, натрия гидроксид, калия гидроксид, хлорид натрия, сульфат меди (II), тар тр ат натрия (Реахим, Ро ссия); 3-(2-пиридил)-5,6-дифенил-1,2,4-триа-зин-4',4''-дисульфоновой кислоты натриевая соль (феррозин), 12-0-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат, 4-(4,6-димитокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолин хлорид (БМТММ), форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА), глутаровый ангидрид (81§ша-ЛЫпсЬ, США); фосфатно-солевой буфер ный раствор (ПанЭко, Ро ссия). Буферные растворы с рН 5,4 (ацетат натрия/уксусная кислота) и рН 7,4 (фосфат натрия одно/двузаме-щенный) были приготовлены на дистиллиро-ванной воде, дополнительно очищенной на установке МПН^ (МШроге, США).
Получение и характеристика карбоксилиро-ванного производного таксифолина. Пентаглу-тарат таксифолина был получен в результате этерификации полифенола в присутствии глу-тарового ангидрида по модифицированному методу, описанному ранее [13]. Для этого 570,5 мг глутарового ангидрида в 5 мл безводного тетрагидрофурана смешивали с 10 мг КОН и затем при постоянном нагревании при 80°С в течение часа добавляли 304 мг таксифолина, растворенного в 5 мл тетрагидрофурана. Смесь нагревали в течение трех часов, после чего раствор упаривали под вакуумом. П р одукт реакции, полученный в виде масла, представляет собой пентаглутрарат таксифолина (Я { = 0,246, бензол:ацетон:этанол 8:2:1; 1Н-ЯМР (600 МГц, Б20) 8 5,12 (1Н, а, ] = 12 Гц, Н-2); 5,02 (1Н, а, ] = 12 Гц, Н-3); 5,93 (1Н, 8, Н-6); 6,00 (1Н, 8, Н-8); 6,97 (1Н, ш, Н-5'); 7,24/7,10 (1Н, ш, Н-2'/6'); 1,97 (6Н, ш, СН2(СН2)2); 1,88 (12Н, ш, -СН2С00); 2,66 (2Н, ш, СН2(СН2)2); 1.63 (4Н, ш, -СН2С00); 2,20 (2Н, ш, СН2(СН2)2); 1,73 (4Н, ш, -СН2С00); 13С-ЯМР (150 МГц, Б20) 8 181,61/181,06/179,61/179,54/178,26 (С00Н), 162,8/162,77 (С3',С4'), 166,03 (С9), 170,62 (С5), 166,63 (С7), 183,51 (С4), 126,96 (С1'), 120,9 (С6'),
116,3 (С5'), 115,56 (С2'), 102 (С 10), 97,1 (С6), 96,77 (С8), 83,07 (С2), 71,73 (С3), 20,36-21,06 (СН2), 32,8-35,71 (СН2).
Выделение коллагена. Выделение коллагена проводили по ранее описанному методу [14]. Хрящевую ткань, полученную из хвостов крыс, стерилизовали в 70% этаноле и затем помещали в холодный раствор 0,5 М уксусной кислоты из расчета 250 мл кислоты на 1 г хрящевой ткани. Раствор оставляли при постоянном перемешивании при 4°С в течение 72 ч, после чего центрифугировали при 4°С и 7000 g в течение 30 мин для отделения нерастворившейся ткани. После этого к супернатанту добавляли охлажденный 10% раствор КаС1 для преципитации коллагена и оставляли на ночь при 4°С. Коллаген отделяли повторным центрифугиро-ванием при 4°С и 7000 g в течение 30 мин и затем растворяли его в 0,25 М уксусной кислоте при 4°С из расчета 1 г начальной хрящевой ткани на 50 мл. Полученный ра створ диализо-вали против 6 смен 0,1% р а створ а уксусной кислоты в течение трех суток, используя диализные мешки с порами для молекулярного веса 12-14 кДа. До экспер имента раствор коллагена хр анили при 4°С в стер ильной стеклянной таре не более семи суток. Концентрацию коллагена контролировали спектрофотометри-ческим методом, используя расчетный коэффициент экстинкции [15], и стандартным биуре-товым методом [16].
Получение гидрогелей на основе коллагена и глутарата таксифолина. Гидрогель на основе коллагена был получен за счет формирования поперечных сшивок между фибриллами белка с использованием глутарата таксифолина, кар-бокильные группы которого предварительно активировали 4-(4,6-димитокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилмор фолин хлоридом (БМТММ) [17]. К раствору 175 мг глутар ата таксифолина в 5 мл фосфатно-солевого буферного раствора добавляли 158,2 мг БМТММ в 5 мл фосфатно-солевого буфер ного раствор а. Через один час раствор производного таксифолина добавляли к 10 мл 2% раствора коллагена, смесь быстро перемешивали и заливали в лунки 24-луночного планшета в объеме 1 мл до полного формирования геля пр и температуре 37°С и 100% влажности. Через 24 ч гели промывали тремя сменами холодного фосфатно-солевого буфер ного раствора и до анализа хранили при 4°С.
Анализ динамики высвобождения полифенола из геля. Для определения динамики высвобождения полифенола из коллагенового геля фрагмент геля цилиндрической формы объемом 1 мл, содержащий 8,75 мкг полифенола, поме-
щали в 10 мл фосфатно-солевого буферного раствора. Далее спектрофотометрическим методом определяли концентрацию полифенола в буфере спустя определенные промежутки вр е-мени (0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 5,0, 8,0, 16, 24 и 48 ч). Регистрацию спектр ов пр оводили в стандартных 1-сантиметр овых кварцевых кюветах на спектрофотометре Cary Бсаи (Varian, Австралия) при длине волны 326 нм. Расчет концентрации полифенола в растворе проводили по ср еднему коэффициенту экстинкции (е326 = 17556 М-1-см-1). Определение доли высвобождаемого полифенола осуществляли по формуле: CTF% = 100-CTF_S/CTF_G, где CTF_G -концентрация полифенола в геле, измеренная после раствор ения 1 мл геля в 10 мл 1М HCl, C TF S - концентрация полифенола в ср еде инкубации.
Оценка железовосстанавливающей активности полифенола. Опр еделение железовосстанавливающей способности полифенолов проводили с помощью модифицированного феррози-нового метода [18] на спектрофотометре Cary 100 Scan (Varian, Австралия). К 9 мл 1 мМ раствора феррозина в ацетатном буфере (рН 5,4) добавляли 1 мл супернатанта, полученного после инкубации геля. Затем к приготовленным растворам добавляли хлорид железа, конечная концентрация котор ого составляла 100 мкМ, и регистрировали изменение оптической плотности при 562 нм. Концентрацию восстановленного железа определяли по калибровочному графику, для построения которого использовали различные концентрации сульфата железа (II): 0,8, 1,5, 3,0, 6,0, 12,5, 25, 50, 100, 120 мкМ.
Выделение нейтрофилов.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.