№ 4
ИЗВЕСТИЯ АКАДЕМИИ НАУК ЭНЕРГЕТИКА
2008
УДК 577.3
© 2008 г. ВОЛОДИНА Л. А., ФЕДОРОВ Ю. И.
МЕДЬ-ИНДУЦИРОВАННОЕ ТУШЕНИЕ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ТРИПТОФАНА И ВЛИЯНИЕ CuS-КЛАСТЕРОВ НА КИНЕТИКУ ИЗМЕНЕНИЙ рН В СУСПЕНЗИИ КЛЕТОК Escherichia eoli
Изучено влияние микромолярных концентраций Cu(II) в качестве эффектора иодидного тушения флуоресценции триптофана и на кинетику изменений рН в суспензии интактных, деполяризованных, модифицированных N-этилмалеимидом (N3M) (необратимо связывающим SH-группы белков) и дициклогексилкарбодиими-дом (ингибитором транслокации протонов через _Р0-канал АТФазного комплекса) E.coli. Показано, что индуктивный характер тушения флуоресценции триптофана, обусловленный дистанционным воздействием CuS-кластеров в интактных бактериях, коррелирует с активацией _Р0-АТФазной реакции E.coli. Сделан вывод, что полученные результаты свидетельствуют в пользу влияния CuS-кластеров на работу F0F1 -АТФсинтазы.
Введение. Механизм нарушения барьерных свойств внутренней мембраны E.coli при действии ионов меди до сих пор не установлен. Существующие на сегодня гипотезы (например, в работе [1]) оставляют нерешенным ряд вопросов. Поэтому реакции клеточных структур на внедрение в них ионов меди позволяют получить важную информацию для понимания этого процесса. Ранее было показано, что связывание микромолярных концентраций Cu(II) (25 мкМ в среде инкубации) активными центрами внешней поверхности цитоплазматической мембраны (ЦПМ) E.coli характеризуется положительным максимумом на кривой в координатах Скетчарда и Кс, = 2 ■ 105 М-1 [2]. Высокая локальная концентрация ионов меди в этих центрах представляет собой комплексы с азот-кислородными и серосодержащими лигандами [3]. При анализе спектров ЭПР-комплексов и модельных соединений для интактных и NЭM-модифи-цированных бактерий установлено образование в этих областях ЦПМ дипольно-свя-занных и ЭПР-недетектируемых обменно-связанных кластерных агрегаций [4] с сильным обменным взаимодействием (метод статической магнитной восприимчивости [5]). Детальное изучение параметров спектров насыщения центров связывания меди с использованием SH-реагентов позволило сделать вывод, что структуры представляют собой CuS-кластеры [6]. При этом изменяются диэлектрические характеристики ЦПМ: из анализа диаграмм Коула-Коула для зависимости коэффициента диэлектрических потерь (е'') от эффективной диэлектрической проницаемости (е') следует, что сдвиг максимума диэлектрических потерь в сторону высоких частот (от 0.3 до 0.8 Мгц) и уменьшение его интенсивности свидетельствует об исключении больших дипольных фрагментов мембранных структур из процесса релаксации под действием меди [7]. В работе [8] методом ЭПР с использованием положительно заряженного спин-зонда показано, что в этом случае изменяется также плотность отрицательных зарядов на внешних структурах ЦПМ: ионы меди, связанные внешней поверхностью мембраны, в несколько раз уменьшают плотность отрицательных зарядов на ее внутренней стороне, несколько увеличивая ее на внешней. Те же концентрации ионов меди в среде инкубации E.coli, которые обусловили изменения в ЦПМ этих бактерий, добавленные
в среду в начальный момент, увеличивают на ~20% скорость дыхания, ингибируя его впоследствии [9]. Работа молекулярной машины ^0^1-АТФсинтазы осуществляется за счет трансмембранной разности электрохимических потенциалов ионов водорода, Дц +, образующейся на сопрягающей мембране E.coli при переносе электрона по дыхательной цепи и транслокации H+ через протонный канал ^-фактора АТРсинтазы. При этом происходит поворот роторной субъединицы внутри ^0^1-АТФсинтазы (гек-самера а3 ß3), что обусловливает конформационные изменения в этих субъединицах, обеспечивая синтез АТФ в каталитическом сайте ß-субъединицы, пространственно сближенной с а-субъединицей [10, 11]. При реакции фермента с нуклеотидами и фосфатами флуоресценция триптофана а-субъединицы изменяется. Большая чувствительность флуоресценции обусловлена не только непосредственной близостью к каталитическому центру а-субъединицы, но и тем, что в ней содержится два остатка триптофана (в трех, соответственно, их шесть) [10, 12]. Авторы работы [12] использовали чувствительный метод иодидного тушения флуоресценции триптофана в присутствии эффекторов тушения - нуклеотидов и фосфатов, влияющих на характер спектров эмиссии триптофана для количественного описания процесса с помощью уравнения Штерна-Фолмера.
В настоящей работе предпринята попытка обнаружить возможные корреляции изменения характеристик иодидного тушения флуоресценции триптофана при использовании в качестве эффектора ионов Cu(II) c изменением рН в среде инкубации E.coli и ее сферопластов для интактных, истощенных, ^-этилмалемид-(КЭМ) и дициклогек-силкарбодиимид-(ДЦКД) модифицированных бактерий.
Методика. Эксперимент выполнен на 18-ти часовой культуре E.coli В, выращиваемой в стационарных условиях на глюкозо-минеральной среде М-9 при 37°С. Бактерии дважды отмывали от ростовой среды 10 мМ трис-HCl буфером (рН-7,2) и после центрифугирования суспендировали в таком же (или в более слабом) буфере и необходимых рН до значений оптической плотности при X = 630 нм A = 0,5 (для измерений флуоресценции) или A = 5,0, т.е. 1,47 мг/г ■ с ■ м. (для рН-измерений). Сферопласты бактерий получали путем удаления клеточной стенки E.coli при действии ЭДТА и лизоцима в 0,5М сахарозе, последующим центрифугированием и суспендированием в 1 мМ или 0,5 мМ трис-буфере, содержащем 150 мМ хлорида натрия или 0,3М сахарозу [13]. В каждом отдельном случае доводили рН суспензии клеток и сферопластов до рН раствора хлорида меди. Использовали рН-метр рН-121. Проведено пять серий опытов на клетках и три на сферопластах. Инкубировали суспензию клеток с КЭМ и ДЦКД в течение 15 мин при 23°С. Деполяризацию бактерий осуществляли путем истощения E.coli в дистиллированной воде в течение суток при 22°С. Спектры флуоресценции триптофана регистрировали при Хех = 282 нм Хем = 332-334 нм на спектрофлуориметре MPF-4 фирмы "Хитачи" (Япония). Тушитель флуоресценции, иодид, добавляли в диапазоне концентраций 0,05-0,2М, после записи спектра для каждой концентрации иодида в систему вносили 25 мкМ хлорида меди и снова записывали спектр. Концентрация КЭМ в образце - 250 мМ. 1,5 мМ раствор ДЦКД вводили в среду инкубации из спиртового раствора (концентрация спирта при этом в среде не превышала 1%) и из насыщенного раствора в трис-буфере.
Результаты. Спектр флуоресценции триптофана интактных E.coli показан на рис. 1 (1). Можно видеть, что максимум спектра эмиссии несколько размыт, полуширина линии -65 нм. При действии иодида, ионов меди, а также модификаторов ЦПМ-КЭМ и ДЦКД положение максимума эмиссии не изменяется, но при этом наблюдается уменьшение интенсивности (аналогично [12] для нуклеотидов) (рис.1: 2, 2'; 3, 3'; 4, 4'). Данные опытов по тушению триптофановой флуоресценции иодидом и Си(11)-эффекто-ром анализировали, используя уравнение Stern-Volmer, позволяющее выявить характер тушения и определить параметры процесса:
F0/F =1 + Ksv( Q )• exp (V( Q)), (1)
Рис 1. Спектр флуоресценции триптофана интактных бактерий Е.соЦ (1) и амплитуды интенсивности тушения иодидом в присутствии эффектора Си(11) (концентрация хлорида меди 25 мкм): 2 - 50 мМ иодида, 2' -иодид в присутствии 25 мкМ хлорида меди; 3 - 100 мМ иодида, 3' - иодид в присутствии 25 мкМ хлорида меди; 4 - 200 мМ иодида, 4' - иодид в присутствии 25 мкМ хлорида меди
Ро/Р1
Рис. 2. Тушение иодидом флуоресценции триптофана в суспензии интактных клеток Е.соН и модифицированных КЭМ и ДЦКД: 1 - иодид и хлорид меди; 2 - КЭМ, иодид, хлорид меди; 3 - только иодид; 4 - ДЦКД, иодид, хлорид меди
где и ^ - интенсивность флуоресценции без тушителей и с ними соответственно; а -концентрация иодида; КиХ) - константа кинетического тушения, учитывающая частоту столкновений; V - константа статического тушения, когда имеет место дальнодей-ствующий диполь-дипольный безизлучательный перенос электронного возбуждения.
В отсутствие статического тушителя уравнение (1) упрощается
р0/^ = 1 + ки а). (2)
На рис. 2 приведены экспериментальные графики результатов тушения флуоресценции триптофана: в присутствии иодида (3), после преинкубирования Е.соН с КЭМ и последующем действии иодидом и хлоридом меди (2), после предварительного инкубирования с ДЦКД (4), а затем - действия иодида и хлорида меди, кривая 1 характеризует флуоресценцию триптофана после прибавления СиС12 к интактным Е.соН. Прямолинейный характер графиков 2, 3 и 4 позволяет рассчитать константы тушения по
рН 5,8
5,6
5,4
5,2
5,0
0 10 20 г, мин
Рис. 3. Кинетика рН-изменений в среде инкубации сферопластов (кривые 1—3) в 0,5 мМ трис-буфере и суспензии клеток Е.соЦ в 1 мМ фталевокислом буфере (4) при действии только ионов меди и после предварительной модификации ЦПМ КЭМ и ДЦКД или истощения бактерий: 1 - действие хлорида меди на сферо-пласты интактных клеток Е.соЦ; 2 - сферопласты предварительно инкубировали с КЭМ; 3 - сферопласты предварительно инкубировали с ДЦКД; 4 - бактерии Е.соЦ при действии хлорида меди без модификаторов ЦПМ; 5 - истощенные Е.соН
уравнению (2); для иодида КиХ} = 5,3 М-1, для ЮМ модифицированных бактерий = 6 М-1, после действия ДЦКД на Е.соН КиХ) ~ 0 (график почти параллелен оси абсцисс). Изгиб на кривой 1 характеризует индуктивный характер тушения флуоресценции триптофана [12], параметры кривой в этом случае рассчитываются по уравнению (1): = 5 М-1
и V = 5,5 М-1, что свидетельствует в пользу дистанционного влияния эффектора - ме-ди(11), включенного в основном в СиБ-кластер, поскольку согласно [2-4], практически все ионы меди при ее концентрации 25 мкМ в среде образуют комплексы с активными центрами внешней поверхности ЦПМ. После модификации ЦПМ КЭМ, необратимо связывающим сульфгидрильные группы белков, изгиба на кривой 2 практически не наблюдается, зависимость вырождается в прямую с константой тушения, близкой к таковой для иодидного тушения флуоресценции триптофана. Важным результатом является модифицирование клеток ингибитором транспорта протонов ДЦКД, блокирующим протонный канал ^-факт
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.