ЖУРНАЛ ФИЗИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2010, том 84, № 11, с. 2175-2181
БИОФИЗИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
УДК 577.150.3
МЕХАНИЗМ ДИМЕРИЗАЦИИ ФЕРМЕНТОВ ПРИ АДСОРБЦИИ НА СИЛИКАТНЫХ АДСОРБЕНТАХ НА ПРИМЕРЕ ЛИЗОЦИМА И
Р-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ
© 2010 г. Е. С. Чухрай, О. С. Пилипенко, Р. А. Овсянников, Л. Ф. Атякшева,
Е. Е. Князева, И. И. Иванова
Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Химический факультет
E-mail: Chukhrai@phys.chem.msu.ru Поступила в редакцию 22.12.2009 г.
С помощью кинетического анализа адсорбции лизоцима и в-галактозидазы на силохроме, силика-геле и мезопористом силикате показано, что адсорбция соответствует двухстадийной схеме, включающей обратимую "предадсорбцию" и необратимое связывание димеров. Вычислены соответствующие константы скорости адсорбции, десорбции и димеризации. Установлено, что в-галакто-зидаза, адсорбированная на силикагеле и мезопористом силикате, сохраняет ~20% активности, а на силохроме — более 30%.
Адсорбция как метод иммобилизации ферментов позволяет осуществлять необратимую связь белка с твердой поверхностью без существенной потери его каталитических свойств. Однако необратимость адсорбции вносит принципиальные трудности в теоретическую трактовку наблюдаемых явлений. Современные физико-химические теории применимы лишь к предельным случаям, относящимся либо к хаотическому распределению адсорбата, описываемому законом случая, либо к термодинамически равновесным слоям, каковыми адсорбционные слои ферментов не являются. Поэтому на первый план выступает кинетическое изучение процессов необратимой адсорбции белка.
Особенности белка как адсорбата подробно рассмотрены в работе [1], предлагающей кинетический анализ ряда возможных механизмов адсорбции и аргументированный выбор одного из них. В соответствии с этой концепцией необратимая адсорбция белка на однородной поверхности не протекает в виде односторонней, кинетически необратимой реакции
Е + О ^ ЕО,
где Е — молекула фермента, а О — свободное место на поверхности адсорбента, эквивалентное молекулярной площадке адсорбированного фермента — Еадс.
Как правило, адсорбция фермента, обладающего контактной площадкой от 15 до 150 нм2 и более, происходит в результате многоточечного связывания белка с носителем. При этом возникает контакт фермент—носитель (ЕО) с определенным структурным соответствием между сильно взаимодействующими участками поверхности
фермента и носителя — специфический прочный контакт (ЕОпр). Возникновению этого контакта предшествует обратимая адсорбция
Е + О -о- ЕОсл, где ЕОсл — неспецифический слабый контакт. Он возникает в результате случайного соударения молекулы фермента с поверхностью носителя. Энергия связи адсорбата с поверхностью достаточно мала, поэтому можно ожидать обратимости адсорбции. Модельным представлениям соответствует схема
E + D.
e а
EQ
■пр>
(1)
где къ к-1, и к2 — кинетические константы скорости адсорбции, десорбции и прочного связывания соответственно.
Цель настоящей работы — рассмотреть в рамках схемы (1) кинетические закономерности адсорбции ферментов гидролиза гликозильной связи: яичного лизоцима и ß-галактозидазы из Penecillium canescens (LAC) на силикатных адсорбентах с различными параметрами пористой структуры, установить механизм адсорбции в каждом случае и получить количественные характеристики процесса.
В качестве адсорбатов выбраны белки, различающиеся по функциональному назначению, молекулярной массе, размеру и олигомерному составу. Лизоцим (КФ 3.2.1.17) и LAC (КФ 3.2.1.23) гидолизуют О-гликозильные связи в мукополиса-харидах (стенки бактерий) и полисахаридах соответственно. Подобно всем белкам лизоцим и LAC имеют весьма сложную топографию поверхности молекулы. Например, данные РСА [2] свидетельствуют, что молекула лизоцима компактна, доста-
k
2176 ЧУХРАИ и др
Таблица 1. Параметры пористой структуры адсорбентов
Адсорбент ^БЭЪ м2/г см3/г
Силикагель 23 -
Силохром 120 1.0
Мезопористый силикат 670 0.6
точно устойчива и имеет топографию поверхности с чередующимися полярными и гидрофобными областями, что обеспечивает ей хорошие перспективы как адсорбата [3, 4]. Это же свойство является проблемой в офтальмологии, поскольку лизоцим содержится в окулярной жидкости и весьма активно адсорбируется на контактных линзах. Молекула лизоцима представляет собой одну полипептидную цепь, состоящую из 129 аминокислотных остатков с четырьмя дисульфидными связями, Mr = 14300. Это — удлиненный сфероид с двумя областями, разделенными активным центром. Размеры боковой части молекулы приблизительно 3 х 4.5 нм, а концевой — 3 х 3 нм [5].
LAC из Pen. canescens (Mr мономера — 120000) обладает общими со всеми известными грибными ферментами свойствами, однако авторы [6] отмечают и некоторые особенности LAC из Pen. canescens. Этот фермент активен не только в кислой, но и в нейтральной среде, что выгодно отличает его от других лактаз грибного происхождения и расширяет перспективы практического использования. Помимо активности в реакциях гидролиза лактазы участвуют в реакциях трансгликозили-рования при синтезе олиго- и полисахаридов [7].
р-Галактозидаза из Pen. canescens является тетраме-ром, размер молекулы 12 х 12 нм [8].
Термостабильность и высокая активность LAC Pen. canescens делают целесообразным иммобилизацию этого фермента на различных твердых носителях и поиск факторов, увеличивающих стабильность и активность. В качестве носителей исследованы тозилированная хлопчатобумажная ткань, хитозан, сефароза-4В, пенный полиуретан и некоторые другие адсорбенты [9, 10]. Наибольшее количество фермента адсорбируется на поверхности хитозана, где он проявляет высокую стабильность и активность в реакции гидролиза лактозы в молочной сыворотке.
Лизоцим оказался хорошим адсорбатом при адсорбции на мезопористых молекулярных ситах типа МСМ-41 и SBA-15 [3, 4, 11]. Максимальная адсорбция лизоцима на AlSBA-15 (^уд = 604 м2/г и D^p ~ 12 нм) составила 580 мг/г (pH 9.6). Кривые сорбции лизоцима при T = const в интервале pH 6.5—10.5 соответствуют модели изотерм Ленгмю-ра (тип L), тогда как кривые сорбции, полученые при pH12, соответствуют модели S-образных изотерм (тип S) [3]. В работах [4, 11] приведены данные по адсорбции лизоцима на молекулярных ме-зопористых ситах SBA-15 и показано, что предельная адсорбция зависит от pH, увеличиваясь от 250 до 500 мг/г с повышением pH от 5 до 8. Величина адсорбции приблизительно одинакова на образцах, размер пор которых составляет 8 и 24 нм и значительно меньше на образце с размером пор 4 нм. Авторы [4, 11] полагают, что на ме-зопористом силикате SBA-15 с диаметром пор 4 нм адсорбция лизоцима происходит только на внешней поверхности носителя.
(dV/dD) х 104, см3/(г А)
Рис. 1. Распределение объема пор по их диаметру для силохрома (1) и мезопористого силиката (2).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Ферменты. Исследована адсорбция лизоцима из яичного белка (НПО "Биохимреактив"), LAC из Pen. canescens (штамм F-178) полученной во ВНИИ "Биотехника". Содержание белка в препаратах определено методом Брэдфорда и составляет 15% в LAC и 52% — в лизоциме.
Адсорбенты. Использовали два адсорбента промышленного производства — гидротермальный широкопористый силикагель (силикагель) и сило-хром C-120 (силохром). Третий адсорбент — мезо-пористый силикат (МС) — синтезирован методом мицеллярного темплатирования. В качестве тем-плата использовали полиэтиленгликоль. Характеристики пористой структуры адсорбентов, приведенные в табл. 1, определяли из изотермы низкотемпературной адсорбции азота, полученной на поромере ASAP 2010N (Micromeritics). На рис. 1 приведены кривые распределения пор по размерам для силохрома и МС.
Адсорбционные измерения. Адсорбцию лизоцима проводили из фосфатного буферного раствора pH 6.0. За кинетикой адсорбции ферментов следили по изменению концентрации белка в контактных растворах. Концентрацию лизоцима определяли спектрофотометрически при 280 нм. Адсорбционные измерения осуществляли при начальных концентрациях лизоцима 25-70 мкМ, время адсорбции варьировали от 0.5 до 7 ч.
Адсорбцию LAC проводили в оптимуме pH активности фермента (pH 4.5) из фосфат-цитратно-го буфера. Концентрацию LAC в контактных растворах считали пропорциональной ферментативной активности. Активность фермента определяли по начальной скорости гидролиза синтетического субстрата о-нитрофенил^^-галактопирано-зида (Sigma). Спектрофотометрически при 420 нм анализировали содержание о-нитрофенола в продуктах реакции гидролиза. Поскольку окрашивание о-нитрофенола проявляется только в щелочной среде, а реакцию гидролиза проводили в оптимуме активности фермента при pH 4.5, то через определенные промежутки времени из реакционной среды отбирали пробу с объемом 0.5 мл и помещали в пробирку с 1 М раствором Na2CO3. Начальную концентрацию фермента изменяли в пределах 0.07-7 мкМ, адсорбционные измерения проводили при временах адсорбции 1-300 ч.
Величину адсорбции рассчитывали по разнице начальной и текущей концентрации ферментов.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Уже первые данные о струткуре лизоцима, полученные в 60-х годах [2], указывают на неоднородность топографии поверхности белка и наличие неодинаковых контактных участков, ответственных как за межбелковое связывание с образованием ассоциатов типа димеров, так и возможностью многоточечного связывания белка с адсорбентом. Усложнение реальной схемы адсорбции белка состоит в том, что даже при необратимости связывания экспериментально обнаруживается обратимая "предадсорбционная" стадия [1, 12, 13]. Простейшая кинетическая схема адсорбции фермента на твердом носителе, учитывающая наличие обратимой стадии, предложена в [1] и имеет вид (1).
Подробный кинетический анализ этой схемы приведен в работе [1], а способы расчета кинетических постоянных содержатся также в [12-14] на примере LAC, пероксидазы и гемоглобина.
Если прочно связанными оказываются не мономеры, а димеры E2, как показано в работе [13] для LAC, то кинетической схемой будет:
где k2 — константа скорости димеризации через раствор.
Согласно схеме (2) необратимая стадия связана с возникновением на поверхности необратимо связанног
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.