МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 5, с. 536-545
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
МЕХАНИЗМ ОБРАЗОВАНИЯ ПРОСПОР В ПРОЦЕССЕ ПОЛИСПОРОГЕНЕЗА У АНАЭРОБНОЙ БАКТЕРИИ ШЛЕЮБЛСТЕЯ РОЬУЕМВОЗРОЯт PS-1T © 2015 г. В. И. Дуда*, **, Н. Е. Cузина*
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, Московская обл.
**Пущинский государственный естественно-научный институт, Московская обл.
Поступила в редакцию 19.02.2015 г.
Процесс образования проспор у анаэробной бактерии ЛпаегоЬаМегро1уепйо$роги$ Р$-1т (Р81т) изучен с помощью фазово-контрастной, флюоресцентной и электронной микроскопии. Полученные данные позволяют заключить, что образование всех проспор в многоспоровых спорангиях у изученной бактерии осуществляется с помощью того же клеточного механизма, который функционирует у всех известных бацилл и клостридий в случае моноспорового варианта эндогенного спорогенеза. Цитологически он детектируется по таким характерным показателям, как: 1) образование проспо-ровой септы, 2) поглощение (е^иИшеМ) меньшей клетки (предспоры) большей (материнской), 3) синтез кортекса, 4) сборка покровов, 5) формирование экзоспориума и 6) лизис материнской клетки. Важной особенностью полиспорогенеза у бактерии Р81т является синхронность в образовании всех спор (близнецов) в одном спорангиуме и отсутствие каких-либо признаков деления про-спор до их созревания в материнских клетках. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что происхождение множества спор в одной клетке у бактерии Р81т не связано с размножением про-спор, возникающих первыми на одном или двух геометрических полюсах материнской клетки, как это утверждается некоторыми авторами для другой многоспоровой бактерии — "Ме(аЬас(епиш ро1у$рога", а с одновременным независимым образованием предспор в одной и той же материнской клетке по типу модифицированного клеточного деления.
Ключевые слова: полярность клеток, трансверсия полярности, полиспорогенез, ультраструктурная организация, нуклеоид, предспоры, проспоры, споры-близнецы.
DOI: 10.7868/S0026365615050067
Моноспоровый вариант эндогенного спорогенеза у известных видов бацилл подробно изучен с помощью различных методов цитологии, физиологии, биохимии и молекулярной генетики. Вскрыты фундаментальные закономерности этого уникального биологического процесса, которые позволили выяснить вопросы о путях происхождения новой молодой клетки, возникающей в недрах старой (материнской), об особенностях клеточной дифференцировки прокариот и возникновении de novo уникальных клеточных структур (Fitz-James, Young, 1969; Long et al., 1983; Zupancic et al., 2001; Errington, 1993, 2003; Iber et al., 2006; Дуда, 1982). Важнейшим выводом из проведенных исследований является положение о том, что эндогенный спорогенез представляет собой особый случай модифицированного клеточного деления. В этом отношении исследования бактериального полиспорогенеза (ПС) открывают но-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: duda@ibpm.pushchino.ru).
вые горизонты в изучении структурно-функциональных возможностей прокариотной клетки. Объектами этих исследований могут являться такие многоспоровые бактерии, как культивирующиеся штаммы почвенной анаэробной бактерии Anaerobacter polyendosporus и развивающейся в кишечнике морской свинки " Metabacterium polyspora". Эндоспоры A. polyendosporus обладают типичными для бактериальных эндоспор (ЭС) признаками: они содержат дипиколиновую кислоту, обладают повышенной термоустойчивостью и характерными для ЭС структурами (Duda et al., 1987; Siunov et al., 1999). Недавно нами было установлено, что определяющим условием для осуществления эндогенного ПС является процесс трансверсии клеток от биполярности к многополярности, сопровождающийся образованием множества локализованных по периферии и связанных с цитоплазматической мембраной нуклеои-дов. Эти нуклеоиды становятся центрами образова-
ния ЭС (Дуда и соавт., 2014). Однако дальнейшая последовательность цитологических процессов ПС детально не изучена. Между тем, эти данные важны для оценки путей образования ЭС в многоспоровых спорангиях. Так, Angert, Losick (1998) и Ward, Angert (2008) на основании изучения "Me-tabacteriumpolyspora" сделали вывод о том, что появление множества ЭС в одном спорангиуме является следствием размножения первых двух проспор, первоначально возникших на двух геометрических полюсах палочковидной материнской клетки. Возможность осуществления полиспорогене-за по данному сценарию у A. polyendosporus не изучалась. Поэтому цель настоящего исследования состояла в детальном цитологическом изучении последовательности процессов, сопровождающих спорообразование у бактерии A. polyendosporus PS-1T.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования. В исследованиях использовали штамм A. polyendosporus PS-^, подробно описанный в работах (Duda et al., 1987; Si-unov et al., 1999). Бактерию выращивали на средах: картофельный агар (КА) и синтетическая среда — жидкая (СС) и агаризованная (ССА), состав которой был ранее предложен Пфеннигом (Pfennig, 1965). В эту среду добавляли микроэлементы по Пфеннигу и Липперту (Pfennig, Lip-pert,1966), дрожжевой экстракт ("Difco") — 0.05%, глюкозу либо галактозу в различной концентрации (в %): 0.1; 0.2; 0.3; 0.5; 1.0; 1.5; 2, а также тио-гликолат натрия (0.1 мг/мл). Культуры в жидкой среде выращивали, используя методику Хангейта (Hungate, 1966), а посевы на агаризованной среде инкубировали в микроанаэростатах, заполненных очищенными от кислорода N2 (95%) и CO2 (5%).
Фазово-контрастная микроскопия. Изучение объектов в фазово-контрастном режиме проводили в световых микроскопах ЛЮМАМ ("ЛОМО", Россия) и OPTON ICM 405 ("Zeiss", Германия).
Флюоресцентная микроскопия. Для эпифлюо-ресцентной микроскопии клетки фиксировали 1.5% глутаральдегидом в течение 30 мин и окрашивали 4,6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлори-дом (ДАФИ) ("Molecular Probes, Inc.") концентрацией 1 мкг/мл в течение 5 мин. Прижизненное флюорохромирование клеток акридиновым оранжевым (АО) (5 мкг/мл,) осуществляли при рН 6.0 в течение 5 мин. Препараты просматривали в микроскотх ЛЮМАМ ("ЛОМО", Россия) и Polyvar ("Reichert", Австрия) при возбуждении флюоресценции УФ-светом с максимумом в обла-
сти 360 нм (для препаратов, флюорохромирован-ных ДАФИ) и синим светом (фильтр 400—490 нм, для препаратов, окрашенных АО). Применение АО имеет важное значение, поскольку обеспечивает прижизненную окраску. Так как цитоплазма-тические включения у изучаемой бактерии отсутствуют, то структуры, флюоресцирующие зеленым светом, можно относить к нуклеоидам, проспоры же в этих условиях флюоресцируют красным или оранжевым светом.
Электронная микроскопия ультратонких срезов.
Для приготовления ультратонких срезов клетки концентрировали центрифугированием (10000 g, 15 мин) и фиксировали в 2.5%-ном растворе глу-тарового альдегида в 0.05 М какодилатном буфере (рН 7.2) в течение 1 ч при 4°C. Затем материал трижды отмывали 0.05 М какодилатным буфером (рН 7.2) и дополнительно фиксировали 2%-ным раствором OsO4 в том же буфере в течение 4 ч при 18—20°C. Материал помещали в агар, обезвоживали этанолом и заключали в смолу Epon 812. Капсулы с образцами выдерживали в термостате при температуре 37°C в течение одних сут, а затем при температуре 60°C в течение двух сут. После завершения полимеризации получали срезы на ультратоме LKB 2128 ("LKB Produkter", Швеция). Срезы монтировали на опорные сеточки, покрытые формваровой подложкой, окрашивали 3%-ным раствором уранилацетата в 70% этаноле и дополнительно конрастировали цитратом свинца по Рейнольдсу (Reynolds, 1963).
Получение реплик криосколов клеток. Реплики криосколов получали по методике, описанной в нашей работе (Duda et al., 2001).
Срезы и реплики просматривали в электронном микроскопе JEM-100B ("JEOL", Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Первые признаки начала формирования эндоспор (ЭС) в потенциально многоспоровых клетках при световой (флюоресцентной и фазово-контрастной) микроскопии проявляются в виде множества периферически локализованных нук-леоидов (рис. 1). Эти нуклеоиды при окраске АО флюоресцируют зеленым или светло-зеленым светом в люминесцентном микроскопе (рис. 1). Они также хорошо окрашиваются ДАФИ, как показано нами в предыдущей нашей работе (Дуда и соавт., 2014), в которой более подробно рассмотрено поведение ядерного вещества при спорообразовании. Кроме того видно, что зеленые тельца, имеющие размытые края, превращаются в более четко морфологически выраженные эллипсовид-
Рис. 1. Спорулирующие клетки из 7-сут культуры Anaerobacter polyendosporus PS-1T, выросшей на синтетической среде с 0.2% галактозы. Эпифлюоресцент-ная микроскопия, флюорохромирование АО. Обозначения: Н — нуклеоид; П — проспора. Длина масштабной линейки 5 мкм.
ные или шаровидные тельца, окруженные оболочкой и приобретающие оранжевую окраску. Эти тельца, по-видимому, представляют собой предспоры (ПдС) или проспоры (П), что согласуется с приведенными ниже данными электронной микроскопии. Следует отметить, что дифференциация ПдС от П в световом микроскопе затруднительна, но они хорошо выявляются в электронном микроскопе (как на репликах крио-сколов, так и на ультратонких срезах) (рис. 2—4). На ультратонких срезах ПдС имеют вид расположенных латерально участков цитоплазмы с нук-леоидом, отделенных от цитопламы крупной клетки септой, состоящей из двух трехконтурных мембран. Нуклеоид в ПдС выявляется как локализованная в центре ПдС электронно-прозрачная область, заполненная электронно-плотными нитями и гранулами ДНК (рис. 4). Комплекс про-
Рис. 2. РР-поверхности криосколов мембран предспор, локализованных на полюсе материнской клетки. Электронно-микроскопическая криофрактография. Обозначения: ПдС — предспора; МК — материнская клетка; РР — протоплаз-матическая сторона поверхности скола. Длина масштабной линейки 1 мкм.
Рис. 3. Предспоры — однополюсные близнецы. Электронно-микроскопическая криофрактография. Показана ЕР-поверхность скола мембран. Обозначения: ПдС — предспора; МК — материнская клетка; ЕР — экзоплазматическая сторона поверхности скола. Длина м
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.