УДК 577.352.4
МЕХАНИЗМЫ ГЕНЕРАЦИИ И КЛАССИФИКАЦИЯ СПОНТАННЫХ Са2+-ВОЛН В КАРДИОЦИТАХ. ВОЛНЫ УСТОЙЧИВОГО ТИПА ДЛЯ ОЦЕНКИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО УРОВНЯ КАЛЬЦИЯ © 2013 г. А. В. Мальцев, Ю. М. Кокоз*
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино, Московская область, ул. Институтская, 3; *электронная почта:goicr@rambler.ru Поступила в редакцию 27.12.2012 г.
В настоящей работе исследовались спонтанные Са2+-волны в изолированных кардиомиоцитах крыс. Установлено, что генерация спонтанных Са2+-волн в сердечных клетках может не сопровождаться сокращениями кардиомиоцитов. Са2+-волны полностью подавлялись в присутствии рианодина — ингибитора рианодиновых рецепторов (КуЯз), в то время как селективный ингибитор 1Р3 рецепторов (ТРз^з) ксестоспонгин С кратковременно снижал частоту осцилляций. Это свидетельствует о том, что основной вклад в спонтанные осцилляции внутриклеточного Са2+ вносит Са2+-индуцированное высвобождение депонированного Са2+ через КуЯз-каналы. Блокатор №+/Са2+-обменника КВ-Я7943 не влиял ни на частоту, ни на амплитуду спонтанных Са2+-волн, что указывает на незначительный вклад №+/Са2+-обмена в их генерации. Существенное снижение частоты и амплитуды Са2+-волн наблюдалось при уменьшении внеклеточной концентрации Са2+ до 1 мкМ, что свидетельствовало о том, что генерация Са2+-волн сопровождается входом наружного Са2+. Предлагается детальная классификация спонтанных Са2+-волн и рассматривается вопрос о возможности использования изолированных кардиомиоцитов, генерирующих волны устойчивого типа, для количественной оценки внутриклеточного уровня Са2+ и анализа механизмов возбудимости сердечных клеток.
Ключевые слова: спонтанные Са2+-волны, рианодиновые рецепторы, потенциал-зависимые Са2+-кана-лы, саркоплазматический ретикулум.
DOI: 10.7868/S0233475513030079
Возникновение спонтанных Са2+-волн в изолированных кардиомиоцитах — явление малоизученное. Существующие экспериментальные работы по исследованию этих волн, главным образом, касаются их "морфологии" (оценка скорости, амплитуды, кинетики кальция, его распространения внутри клетки в пространстве и времени) [1—5]. Механизмы, участвующие в генерации спонтанных Са2+-волн до сих пор остаются слабо изученными, а в математических моделях [6—8] их появление связывают с активностью рианодиновых рецепторов (RyRs) саркоплазматического рети-кулума. Считается, что Са2+ из ретикулума может высвобождаться при участии двух различных механизмов. Первый осуществляется через RyRs, которые колокализованы и функционально сопряжены с потенциал-зависимыми Са2+-канала-ми L-типа (VGCC, voltage-gated calcium channels) и образуют так называемые Са2+-высвобождаю-щие единицы (Ca2+-release units) [9]. В этом случае вход наружного Са2+ через Са2+-каналы L-ти-па инициирует выброс депонированного Са2+ за
счет стимуляции Са2+-зависимых RyRs [9]. Второй механизм не зависит от сопряжения RyRs с VGCC (т.е. реализуется, когда VGCC закрыты). В этом случае высвобождение Са2+ осуществляется случайным открыванием одного или нескольких RyRs, однако этого может оказаться достаточным для запуска классического Са2+-зависимого Са2+-выброса [9]. При визуализации Са2+ в клетках с помощью Са2+-чувствительных зондов в обоих случаях наблюдаются Са2+-спарки (sparks) — локальные всплески Са2+, отражающие кластерную организацию RyRs [10]. Также иногда употребляется термин "берст" (burst), указывающий на появление в рядом расположенных участках нескольких спарков, которые инициируют продолжительную, но "затухающую" Са2+-активность (при том, что время жизни самого спарка составляет в среднем несколько сотен миллисекунд) [9]. В условиях Са2+-перегрузки клеток число спарков в единицу времени может превысить критический уровень, и локальная Са2+-сигнализация может трансформироваться в глобальную. Это
проявляется в виде Са2+-волн — длительных Са2+-осцилляций, которые в ряде работ считаются потенциальным триггером различных сердечных аритмий [8, 11, 12]. Хотя обычно возникновение этих спонтанных Са2+-волн ассоциируется целиком с RyRs и механизмами регуляции их активности [10], есть основание считать, что ряд других факторов может играть роль в осцилляторном поведении на внутриклеточного Са2+.
Цель настоящей работы — определить основные механизмы, участвующие в генерации спонтанных Са2+-волн в изолированных кардиомиоци-тах, предложить их феноменологическую классификацию и определить тип спонтанных Са2+-волн, при которых их характеристки стационарны и поэтому могут быть использованы для анализа действия веществ на кардиомиоциты.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Выделение клеток. Изолированные кардиомиоциты получали из сердец крыс Sprague Dawley и Wistar методом, описанным ранее [13]. Вес животных 200—250 г. Базовый раствор содержал (в мМ, pH 7.25): NaCl - 80, KCl - 10, KH2PO4 - 1.2, MgSO4 - 5, глюкоза - 20, тaурин - 50, HEPES - 10, Z-аргинин - 1. Выделенное сердце перфузирова-ли по Лангендорфу. Растворы подавали через буферную емкость (10 мл) в непрерывном режиме. Для отмыва препарата от крови (3-5 мин) использовали среду DMEM + 10 мМ HEPES, рН 7.25. После стабилизации сердечных сокращений перфузию проводили базовым раствором c буфером Ca2+-EGTA (pCa = 7) до остановки сердца (около одной минуты). Затем перфузию продолжали раствором следующего состава: в 100 мл базового раствора добавляли проназу E - 20 мг, бычий сывороточный альбумин (5 фракция) - 100 мг, СаС12 -140 мкМ. Через 3-4 мин раствор, стекающий с препарата, приобретал вид вязких капель, после исчезновения которых перфузия прекращалась (общее время перфузии раствором с проназой не превышало 10 мин). Сердце снимали с канюли, помещали в базовый раствор с добавлением 200 мкМ CaCl2 и измельчали до небольших фрагментов объемом 6-10 мм3. Диспергирование ткани на индивидуальные клетки, как и всю процедуру выделения клеток, проводили при температуре 37°С в том же растворе с проназой при скорости вращения мешалки 1-2 об/с. Для разделения ткани на индивидуальные клетки в начале процесса диспергирования добавляли 2-3 мг коллагеназы (тип IV) на 10 мл раствора с проназой. Через 20 мин брали первый слив. Раствор с полученными клетками очищали от недисперги-рованной ткани и агрегатов пропусканием через нейлоновую сетку. Оставшуюся ткань вновь диспергировали на мешалке в растворе с проназой и коллагеназой. Разделение, как правило, заканчи-
валось за 2—4 цикла. Клетки хранили при комнатной температуре в базовом растворе, содержащем 200 мкМ Ca2+.
Измерение внутриклеточной концентрации Са2+ ([Ca2+]jJ в кардиомиоцитах. Суспензию кар-диомиоцитов в сбалансированном солевом растворе Хенкса (HBSS), содержащем в мМ: NaCl — 138; CaCl2 - 1.3; MgSO4 - 0.4; MgCl2 - 0.5; KCl -5.3; KH2PO4 - 0.45; NaHCO3 - 4; Na2HPO4 - 0.3; глюкоза - 10; Z-аргинин - 1; HEPES - 10, рН 7.4, наносили на круглые покровные стекла и оставляли на 15 мин для прикрепления клеток. Затем раствор заменяли на HBSS с добавлением 5 мкМ Fluo4-AM и инкубировали в термостате при 37°С. Через 40 мин клетки трижды отмывали HBSS, инкубировали 10 мин и использовали в эксперименте в течение 3 ч.
Серии изображений спонтанных Са2+-волн получали на конфокальном микроскопе Leica TCS SP5 (Leica, Германия), оборудованном Ar-ла-зером (488 нм), или на инвертированном микроскопе Eclipse TS100F с флуоресцентным модулем T1-FM (Nikon, Япония).
В ряде экспериментов по регистрации [Са2+]ь осуществляли экстраклеточную стимуляцию клеток короткими прямоугольными импульсами тока, пропускаемого через платиновые электроды; с амплитудой на 50% выше пороговой. Пороговое значение тока подбиралось индивидуально для каждого отдельного эксперимента.
Изменение [Ca2+]in оценивали по изменению интенсивности флуоресценции Ca2+-чувстви-тельного зонда Fluo4 с максимумом возбуждения при 488 нм и максимумом эмиссии при 516 нм. Снижение интенсивности флуоресценции зонда Fluo4 соответствовало снижению [Ca2+]in. Записи одиночных экспериментов представлены как за-F — F
висимость F = -0 от времени, где F - интен-
F
^ ср
сивность флуоресценции в текущий момент времени, F0 - значение фона, F^ - усредненная интенсивность флуоресценции в контроле (до подачи действующих соединений). Измерения проводились на спонтанно-активных кардиомиоцитах (кроме экспериментов, в которых использовалась электрическая стимуляция клеток). Концентрацию свободного Са2+ в Са^-EGTA буфере рассчитывали с использованием стандартной программы (http://www.stanford.edu/~cpatton/ CaEGTA-TS.htm). Обработку результатов проводили с помощью программ ImageJ и SigmaPlot 8.0. Для оценки действия различных соединений на кардиомиоцитах с устойчивой динамикой Са2+-волн использовались усредненные значения амплитуды и частоты на промежутке 60 с до подачи (контроль) и после установления новой кинетики Са2+-волн под действием веществ.
Рис.1. Спонтанные Са2+-волны в изолированных кардиомиоцитах. 1—12 — Записи одиночных кадров во времени, отображающие распространение спонтанных волн. В области цитоплазмы, куда еще не дошла волна, можно видеть локально возникающие Са2+-спарки в виде ярких светящихся точек. Промежуток времени между двумя соседними кадрами — 1 с.
Статистическая обработка результатов. Полученные данные (кроме оригинальных записей флуоресценции во время эксперимента) показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, определявшиеся для данного числа экспериментов (п). Выводы о достоверности действия использовавшихся ингибиторов сделаны на основании сравнения полученных средних значений частот и амплитуд в контроле и в присутствии соединений с использованием критерия Стью-дента при уровне значимостир < 0.05.
Реактивы, используемые в экспериментах: коллагеназа, тип IV ^ойМ^оп, США), протеаза ^1ика, Германия), Fluo4-AM (1пуйго§еп, США), ксестоспонгин С, 2-АРВ (2-аминоэтоксидифе-нилборат), соединение КВ-Я7943 (Тоет, Великобритания). Остальные вещества были производства фирмы Sigma—A1drich (США).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Механизмы генерации спонтанных Са2+-волн
На рис. 1 представлена серия последовательно полученных конфокальных изображений мгновенного распределения Са2+-зависимой флуоресценции,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.