БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2014, том 31, № 3, с. 168-176
УДК 577.23;57.053.2
МЕХАНОЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ ПОРЫ В ТИЛАКОИДНЫХ МЕМБРАНАХ
ХЛОРОПЛАСТОВ
© 2014 г. В. К. Опанасенко1*, И. А. Найдов1, Л. А. Васюхина2
Институт фундаментальных проблем биологии РАН, 142290, Московская обл., Пущино, ул. Институтская, 2;
*электронная почта: vopanasenko@mail.ru 2Клиническая больница № 50 ФМБА России, 607140, Нижегородская обл., Саров, ул. Зернова, 72
Поступила в редакцию 05.08.2013 г.
С помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии исследовали действие осмотического давления в люменах на ионную проницаемость мембран тилакоидной системы хлоропластов гороха. Градиент давления на мембранах создавали, освещая суспензию в присутствии аминов или применяя осмотический шок в среде без сахарозы. Активацию неспецифических пор регистрировали по увеличению проницаемости тилакоидных мембран для флуоресцентного красителя суль-фородамина Б; изменения площади оптического среза тилакоидной системы оценивали по распределению интенсивности флуоресценции хлорофилла. Показано, что в средах с 0.2 М сахарозой даже при полном разобщении аминами тилакоиды не набухали, однако разобщение метиламином сопровождалось входом в люмены сульфородамина. В среде без сахарозы тилакоиды набухали в темноте (как результат шока) и на свету (в присутствии акцептора электронов). Без аминов свет индуцировал вход красителя в люмены тилакоидов и набухание органелл. Мы полагаем, что поры в тилакоидных мембранах активировались образованием АрН в сочетании с высоким осмотическим давлением ионных градиентов амина и хлора или с изменением свойств мембран после осмотического шока. Предполагается, что неспецифические поры в тилакоидах хлоропластов существуют in vivo. Они могут играть определенную физиологическую роль в модификации мембранной проводимости для аммония и малых полипептидов.
Ключевые слова: поры, тилакоиды, моноамины, конфокальная микроскопия.
Б01: 10.7868/80233475514020066
Механочувствительные поры были открыты около 30 лет назад. Как оказалось, они принимают участие в различных процессах метаболизма на разных клеточных уровнях — от регуляции кровяного давления млекопитающих до управления раскрытием устьиц в листьях растений. Механочувствительные поры найдены у прокариот и эу-кариот. Проведено компьютерное моделирование бактериальных пор М8сЬ и М8с8, т.е. каналов с большей (3 нС) и меньшей (1.5—2.0 нС) проводимостью, определена их пространственная структура. Показано, что М8сЬ-каналы имеют поры диаметром 2.5—3.0 нм, они неселективны и рН-зависимы, в то время как М8с8-каналы проводят преимущественно анионы и управляются мембранным потенциалом [1—5]. Подобные поры найдены также в плазматических мембранах высших растений, в их корнях и протопластах [6, 7].
Механочувствительной оказалась и известная Са+-активируемая пора внутренней митохондри-альной мембраны, играющей в митохондриях роль, сходную с ролью мембраны тилакоидов в хлоропластах — обе содержат АТР-синтетазы и
все комплексы цепи электронного транспорта. Активация митохондриальной поры требует гораздо меньшей концентрации кальция, если объем ми-тохондриального матрикса уменьшен в 2—3 раза (0.2 М сахароза в реакционной среде заменена 0.4 М) [8]. Снижение объема матрикса сопровождается увеличением пространства между внешней и внутренней мембранами митохондрии. Это межмембранное пространство соответствует тилако-идным люменам, поэтому логично было предполагать возможность активации механочувствитель-ных пор в тилакоидных мембранах хлоропластов.
Первое сообщение об активации пор в мембранах тилакоидов, набухших в результате осмотического шока, появилось в 1998 г. [9], когда электрофизиологическим методом было показано, что кроме К+-каналов с проводимостью 20— 40 пС, в условиях шока наблюдалась активация неспецифических пор с высокой проводимостью (около 620 пС). Установлено, что флуоресцентный краситель Люцифер желтый может проникать через эти поры внутрь тилакоидов, если последние образуют пузырьки диаметром 5—10 мкм.
Однако образование таких пузырьков нехарактерно для нативных органелл.
Известно, что и без осмотического шока в люменах тилакоидов можно создать давление гораздо более высокое, чем в реакционной среде, если суспензию тилакоидов освещать в присутствии аммония или других гидрофильных проникающих аминов. На свету катионы аммония накапливаются в люменах в соответствии с трансмембранным градиентом pH, а их заряды компенсируются анионами хлора [10—12]. Предполагается, что рост осмотического давления в люменах приводит к увеличению объема тилакоидов, вызывая аммонийное разобщение синтеза ATP и переноса электронов, т.е. диссипацию градиента pH из-за утечки протонов или протонированных аминов из тилакоидных люменов. Считают, что эти утечки могут идти через какие-либо дефекты мембран, через неизвестные (K+/Na+) каналы или поры тилакоидной мембраны [9, 13]. Возможно, катионы некоторых аминов могут пересекать мембрану виде нейтральных солей — комплексов амфифильных катионов аммония с ионами хлора или свободных жирных кислот [14—16]. Если амины активируют механочувствительные поры, открывающиеся под действием осмотического давления, это должно сказываться как на самом аммонийном разобщении, так и на проницаемости мембран для крупных молекул типа Люцифера желтого [9] или сульфородамина Б [17].
Целью настоящей работы было установление связи аммонийного разобщения с набуханием ти-лакоидов и активацией механочувствительных мембранных пор под действием осмотического давления. Градиенты давления на мембранах создавали, освещая суспензию в присутствии аминов или путем осмотического шока в среде без сахарозы. Двулучевая конфокальная микроскопия позволяет одновременно регистрировать индукцию проницаемости тилакоидных мембран для сульфородамина и хлорофилла (Хл), контролируя изменение площади оптического вреза тилакоид-ной системы по распределению флуоресценции Хл. В результате исследования было установлено, что поры в тилакоидных мембранах могут активироваться светом в сочетании с высоким осмотическим давлением градиентов амина и хлора или, после осмотического шока, с образованием ДрН.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Тилакоиды хлоропластов гороха выделяли, как описано ранее [17, 18], промывали и хранили при 0°C в среде, содержащей 0.2 М сахарозу, 10 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 5 мМ HEPES, 5 мМ Tricine (KOH, pH 7.8) и БСА (0.5 мг/мл). По данным электронной микроскопии при такой подготовке образцов хлоропласты теряют внешнюю мембрану и строму, но сохраняют тилакоидную систему,
близкую к системе в нативных хлоропластах; граны и межгранальные тилакоиды при этом не набухают [19].
Электронный транспорт измеряли по выделению Н+ с помощью рН-электрода (с 0.4 мМ фер-рицианидом в качестве конечного акцептора электронов) или кислородного электрода Кларка по поглощению О2 с 0.1 мМ метилвиологеном (МВ). Реакционная среда содержала 0.2 М сахарозу, 10 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 5 мМ HEPES, 5 мМ Tricine (KOH, pH 7.8), акцептор электрона и хлоропласты (40 мкг Хл/мл). Хлоропласты освещали красным светом (X > 600 нм) при температуре 20°C. Для конфокальной микроскопии использовали ту же изотоническую среду, дополненную 50 мкМ сульфородамином и 0.1 мМ МВ. В этих условиях краситель не действовал ни на синтез ATP, ни на перенос электронов от воды к акцепторам фотосистемы 1 (ФС1).
Для наблюдения флуоресценции сульфорода-мина и Хл использовали конфокальный микроскоп Leica TCS SPE. Тилакоиды помещали в кювету с реакционной средой, термостатированной при 20°C, добавляли сульфородамин и метилвио-логен, перемешивая при слабом рассеянном освещении. На предметное стекло наносили 10 мкл суспензии, накрывали покровным стеклом и наблюдали под микроскопом. Микроскоп фокусировали на одном из хлоропластов при слабом освещении через зеленый светофильтр. Все подготовительные операции занимали 30—40 с. Опыт начинали включением импульсного лазерного освещения и фоторегистратора интенсивности флуоресценции. Динамику флуоресценции сульфородамина и Хл регистрировали в конфокальном режиме.
Использование только одного оптического среза позволяет регистрировать динамику флуоресценции с высоким временным разрешением, но движение тилакоидов и изменение площади их проекции в поле зрения оказывают заметное влияние на регистрируемую динамику флуоресценции сульфородамина и Хл. Применение автоматической корректировки фокуса в интервале времени между кадрами позволяет исключить случайные ошибки. При этом микроскоп производит несколько поисковых сканирований флуоресценции Хл около предыдущего положения фокуса и выбирает новое положение фокуса для следующего кадра, чтобы получить наиболее контрастное изображение.
Флуоресценция сульфородамина и Хл попеременно возбуждалась двумя лазерами с длинами волн 532 и 635 нм соответственно. Интенсивность флуоресценции красителя регистрировали в диапазоне 538—590 нм, а Хл — в диапазоне 640—750 нм. Импульсное освещение проводили в течение 5 мин. За это время в ходе каждого опыта парал-
ATP, мкмоль на 1 мг Хл в час 250
200
150
100
50
0
Ve, 10 6 эл.-экв./мг Хл в час 800
600
400
200
8 10 Амины, мМ
8 10 Амины, мМ
Рис. 1. Действие аммония (1) и метиламина (2) на синтез ATP (а) и базальный перенос электронов от воды к метилви-ологену (б) в тилакоидах хлоропластов гороха. Условия экспериментов в изотонической среде приведены в разделе Материалы и методы.
а
0
0
2
4
6
0
2
4
6
лельно получали по две серии из 50—70 изображений тилакоидной системы одного и того же хлоропласта: одна серия соответствовала изменениям флуоресценции сульфородамина, вторая — Хл. Полученные изображения просматривали, выбирая на них участки тилакоидной системы, удобные для измерения поглощения сульфородамина. На первом изображении оптического среза выделяли две области в виде квадратов или окружностей, располагая их внутри и снаружи тилакоидной системы. Эти области автоматически выделялись на всех снимках серии с помощью программы измерения ImageJ [20]. Программа обеспечивала сканирование выбранных областей для получения фотометрических данных, отнесенны
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.