ОНТОГЕНЕЗ, 2009, том 40, № 3, с. 231-236
УДК 57.034:577.217.5+57.085.23
ЦИТОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ
МЕЛАТОНИН СИНХРОНИЗИРУЕТ РИТМ СИНТЕЗА БЕЛКА В КУЛЬТУРАХ ГЕПАТОЦИТОВ КАК АГОНИСТ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО КАЛЬЦИЯ И ПРОТЕИНКИНАЗ1
© 2009 г. В. Я. Бродский, В. А. Голиченков*, Н. Д. Звездина, В. И. Фатеева, Л. А. Мальченко
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 119334 Москва, ул. Вавилова, д. 26 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова 119992 Москва, Ленинские горы
E-mail: brodsky.idb@bk.ru Поступила в редакцию 13.03.08 г.
Мелатонин в наномолярных концентрациях синхронизирует ритм синтеза белка в первичных культурах гепатоцитов путем кальцийзависимой активации протеинкиназ. Синхронизирующий эффект ме-латонина блокируется хелатором цитоплазматического кальция ВАРТА-АМ (20 мкМ), а также ингибитором протеинкиназ 1-(5-изохинолинсульфонил)-5-метилпиперазин дигидрохлоридом (40 мкМ). Таким образом, основное событие синхронизации гепатоцитов мелатонином - фосфорилирование белков, что ранее было нами показано также для ганглиозидов и биогенных аминов. Антагонист рецепторов мела-тонина лузиндол (20 нМ) блокирует синхронизирующую функцию мелатонина.
Ключевые слова: межклеточные взаимодействия, самоорганизация клеток, гепатоциты, мелатонин, ритм синтеза белка, рецепторы мелатонина.
Ряд сигнальных факторов, стимулируя увеличение концентрации свободных ионов кальция в цитоплазме, синхронизирует колебания скорости синтеза белка, приводя к выявлению суммарного околочасового ритма в популяции гепатоцитов in vitro (Бродский и др., 2002, 2006). Сигнальными факторами в этих опытах являлись ганглиозиды гепатоцитов. Аналогичным образом действовали экзогенные ганглиозиды (препарат суммарных ганглиозидов мозга быка или индивидуальный моноси-алоганглиозид GM1) , а также фармакологический аналог норадреналина - фенилэфрин. Эффект синхронизации ритма синтеза белка был показан и для некоторых природных биогенных аминов - норадреналина и серотонина (Звездина и др., 2008), а также для мелатонина (Бродский и др., 2008). Этот гормон, введенный в среду с культивируемыми гепатоцита-ми, синхронизирует ритм синтеза белка в значительно меньших концентрациях, чем другие изученные сигнальные факторы, - 1 нМ (0.23 х 10-6 мг/мл). Для сравнения: эффективные концентрации ганглиози-да GM1 - 0.06-0.2, фенилэфрина - 2-3, норадреналина - 15, серотонина - 20 мкМ.
1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проект < 06-04-48109).
Известно, что мелатонин стимулирует повышение концентрации свободных ионов кальция в цитоплазме эпителиальных клеток (см., например: 8рЬ-1от й а1., 2003). Подобным образом действуют на культивируемые гепатоциты ганглиозиды и некоторые катехоламины. В нашей работе требовалось выяснить, организуется ли ритм синтеза белка путем влияний мелатонина на концентрацию внутриклеточного кальция и на фосфорилировавние белков, подобно тому, как это было нами показано для других сигнальных синхронизирующих факторов. Следовало также выяснить роль специфических рецепторов мелатонина в его синхронизирующей ритм синтеза белка функции.
Изучали первичные культуры гепатоцитов с разной плотностью расположения клеток на стеклах. В плотных культурах с близко расположенными клетками ритм синтеза белка обнару-живется практически сразу после смены среды, т.е. клетки таких культур быстро самосинхронизируются. В разреженных культурах, полученных из той же суспензии изолированных гепатоцитов при ее разведении примерно в 10 раз, ритм выявляется только через несколько часов, т.е. клетки разреженных культур исходно не синхронны. Для ингибирования эффектов цитоплазматического кальция использован его хелатор
ВАРТА-АМ, а для блокады протеинкиназ - их ингибитор Н7 (1-(5-изохинолинсульфонил)-5-ме-тилпиперазин дигидрохлорид), влияющий, в основном, на протеинкиназу С. Механизм действия мелатонина через специфические рецепторы тестировали с использованием лузиндола - антагониста М1- и М2-рецепторов мелатонина (Sjoblom et al., 2003).
Значимость изучения механизмов действия мелатонина определяется тем, что этот гормон используется в лечении некоторых болезней сердечно-сосудистой системы (Малиновская и др., 2004а) и желудочно-кишечного тракта (Малиновская и др., 20046). Мелатонин применяют также как антистрессорный фактор (Арушанян, 2004) и используют в качестве средства для нормализации продолжительности и качества сна (Ковальзон, Вейн, 2004). Изучается защитное действие мелатонина на процесс старения (Анисимов, 2004), а также его противоопухолевая активность (Анисимов и др., 2004).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Гепатоциты самцов крыс Вистар культивировали на стеклах в среде 199 с добавлением 0.2 мг/мл альбумина и 0.5 мкг/мл инсулина ("Sigma", США). Плотные культуры с близко расположенными клетками получали при введении в чашку Петри над стеклами, покрытыми коллагеном, суспензии изолированных гепатоцитов (около 106 клеток/мл). Разреженные культуры получали из той же суспензии клеток, разведенной примерно в 10 раз. Исследовали суточные культуры (подробнее см.: Бродский и др., 2006, 2008).
Метод оценки скорости синтеза белка неоднократно описан нами ранее. Определяли включение 3Н-лейцина в белки и пул свободного меченого лейцина в той же культуре. Рассчитывали величину Icorr - включение лейцина в белки, отнесенное к пулу, автоматически вводя при этом поправку как на вариабельность пула, так и на различное число клеток в культурах. В течение 2 ч последовательно каждые 10 мин брали пробы (по три культуры в пробе); для каждой культуры определяли Icorr и рассчитывали среднее и ошибку для определенной точки времени, а затем общее среднее для данного варианта опыта. Каждый опыт ставили на культурах гепатоцитов одной и той же крысы.
Использовали следующие реактивы ("Sigma", США): мелатонин, ВАРТА-АМ - хелатор внутриклеточного кальция, Н7 - ингибитор протеинкиназ, лузиндол - блокатор М1- и М2-рецепторов мелатонина.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В опыте, результаты которого представлены на рис. 1, выясняли роль ионов внутриклеточного кальция в синхронизации ритма синтеза белка, вызванной с помощью мелатонина. Исследовали разреженные и плотные первичные культуры гепатоцитов молодой крысы. Так же как и ранее (Бродский и др., 2005-2008), в контрольных разреженных культурах ритм синтеза белка не был обнаружен. Средние значения скорости синтеза белка в течение 2 ч наблюдения достоверно не отличались друг от друга и от общей средней для всех точек в пределах ошибки этой средней. Другим контролем действия ВАРТА-АМ было изучение плотных культур. В свежей среде в таких культурах всегда находят ритм синтеза белка, обработка же таких культур ВАРТА-АМ блокировала синхронизацию клеток, и ритм синтеза белка не был обнаружен. Как было показано ранее (Бродский и др., 2008), мелатонин синхронизировал разреженные культуры, и в них обнаружили ритм синтеза белка. После предобработки культур ВАРТА-АМ и при дальнейшем совместном действии ВАРТА-АМ и мелатонина этот гормон не синхронизировал разреженные культуры, и ритм в них не выявлялся.
Торможение активности протеинкиназ ингибитором Н7 блокировало синхронизирующий эффект мелатонина (рис. 2). Исследовали плотные культуры гепатоцитов старой крысы (возраст - 30 мес, вес - 580 г). Ранее в таких культурах находили ритм синтеза белка, хотя и более слабо выраженный, чем в культурах гепатоцитов молодых крыс (Бродский и др., 2005); то же обнаружено и в настоящей работе в контроле (рис. 2). В среду других таких же культур вносили мелатонин (2 нМ) на 5 мин, после чего культуры отмывали и исследовали синтез белка в свежей среде. Средний уровень синтеза белка заметно возрастал, что было отмечено для мелатонина и ранее (Бродский и др., 2008). В третьем варианте того же опыта плотные культуры после отмывки помещали в среду с ингибитором протеинкиназ Н7 на 40 мин, куда в последние 5 мин культивирования вносили 2 нМ мелатонина. В этом случае ритм синтеза белка не был обнаружен, т.е. синхронизирующий эффект мелатонина не проявлялся после подавления активности протеинкиназ. В течение 2 ч наблюдения пробы плотных культур не отличались по интенсивности синтеза белка друг от друга. В четвертом варианте опыта в качестве дополнительного контроля использовали эффективность синхронизирующего действия ранее изученного сигнального фактора фе-нилэфрина на фоне Н7. Без Н7 фенилэфрин, как
Рис. 1. Влияние ВАРТА-АМ - хелатора ионов Са - на вызванную мелатонином синхронизацию ритма синтеза белка в отмытых суточных культурах гепатоцитов молодой крысы: а - контроль, разреженные культуры инкубировали 30 мин в свежей среде с 0.1%-ным ДМСО - растворителем ВАРТА-АМ, отмывали, вновь инкубировали 30 мин в свежей среде с ДМСО, откуда в течение 2 ч брали пробы; б - после 25 мин инкубации разреженных культур с ДМСО в среду вносили 5 нМ мелатонина еще на 5 мин, затем культуры отмывали и вновь инкубировали 30 мин в свежей среде с ДМСО, откуда в течение 2 ч брали пробы; в - после 25 мин инкубации разреженных культур с 20 мкМ ВАРТА-АМ и ДМСО в среду вносили 5 нМ мелатонина на 5 мин инкубации, затем культуры отмывали и вновь инкубировали 30 мин в свежей среде с ДМСО, откуда в течение 2 ч брали пробы; г - плотные культуры инкубировали 30 мин в среде с 20 мкМ ВАРТА-АМ и ДМСО, отмывали и инкубировали 30 мин в свежей среде с ДМСО, откуда в течение 2 ч брали пробы.
Здесь и далее: в каждой пробе брали параллельно три культуры и для каждой измеряли 1С0ГГ и рассчитывали среднюю
для каждой точки времени (-), а также ошибку этой средней (---); по оси абсцисс - время, мин, по оси ординат -
1С0ГГ, имп/мин.
известно, синхронизирует разреженные культуры и повышает амплитуду синтеза белка в плотных культурах старой крысы (Бродский и др., 2002, 2006). В среде с Н7 действие фенилэфрина блокировалось, и он не синхронизировал разреженные культуры молодой крысы.
Таким образом, мелатонин синхронизирует ритм синтеза белка, инициируя цепь реакций: мелатонин ^ увеличение концентрации внутриклеточного кальция ^ активация протеинкиназ ^ ^ фосфорилирование белков. В результате происходит
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.