ОНТОГЕНЕЗ, 2010, том 41, № 2, с. 101-106
ЦИТОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ =
УДК 57.034:577.217.5+57.085.23
МЕЛАТОНИН, ВВЕДЕННЫЙ КРЫСЕ, ЭФФЕКТИВНО СИНХРОНИЗИРУЕТ РИТМ СИНТЕЗА БЕЛКА В ПЕРВИЧНЫХ КУЛЬТУРАХ ГЕПАТОЦИТОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ЭТОЙ КРЫСЫ1
© 2010 г. В. Я. Бродский, С. И. Рапопорт*, Т. К. Дубовая**, Н. Д. Звездина,
В. И. Фатеева, Л. А. Мальченко
Институт биологии развития им. Кольцова РАН
119334 Москва, ул. Вавилова, д. 26
*Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова
119992 Москва, ул. Трубецкая, д. 8
** Российский государственный медицинский университет
117997 Москва, ул. Островитянова, д. 1
E-mail: brodsky.idb@bk.ru
Поступила в редакцию 08.04.09 г. Окончательный вариант получен 06.08.09 г.
Мелатонин, введенный внутрибрюшинно крысе, синхронизирует околочасовой ритм синтеза белка в первичных культурах гепатоцитов, выделенных из этой крысы через 1ч 40 мин после инъекции мелатонина и изученных через 1 или 2 сут. Эффективные синхронизирующие концентрации мела-тонина — 0.01—0.02 мкг/кг веса крысы — на три порядка ниже доз мелатонина, используемых в клинической практике при лечении людей.
Ключевые слова: межклеточные взаимодействия, мелатонин, околочасовые биоритмы, синтез белка.
Ранее мы выявили сигнальные факторы, инициирующие процессы синхронизации околочасового ритма синтеза белка, среди которых особенно выделялся мелатонин (Бродский и др., 2006, 2008, 2009; Brodsky, 2006). Эффективные дозы мелатонина были, по нашим данным, в сотни раз меньше таковых у других изученных синхронизирующих факторов. Значимость изучения механизмов действия мелатонина определяется тем, что этот гормон является ан-тиоксидантом и антистрессорным фактором, а также влияет на продолжительность и качество сна (Анисимов, 2004; Arendt, 1995; Macchi, Bruce, 2004). Мелатонин используется в кардиологической и гастроэнтерологической клинической практике, а также для улучшения состояния здоровья старых людей (Комаров и др., 2004). В наших опытах мелатонин, введенный в наномолярных концентрациях (1—200 нМ) в среду с культурами гепатоцитов, повышал средний уровень синтеза белка и синхронизировал колебания скорости синтеза белка (Бродский и др., 2008). Будет ли проявляться синхронизирующий эффект мелатонина в условиях, приближенных к его использованию в медицине — при введении в
1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных
исследований (проекты № 09-04-00116, 08-04-00144).
организм, а не в среду с клеточными культурами? Чтобы ответить на этот вопрос, мелатонин вводили молодым и старым крысам, затем выделяли гепато-циты, культивировали in vitro и через 1 или 2 сут исследовали в них кинетику синтеза белка.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Методы культивирования гепатоцитов и исследования кинетики синтеза белка изложены ранее (Бродский и др., 2006; Brodsky et al., 2000). Основные приемы были следующими. Гепатоциты самцов крыс Вистар разного возраста изолировали с помощью коллагеназы. Изолированные гепатоциты культивировали на стеклах в бессывороточной среде 199 с добавлением альбумина (0.2 мг/мл) и инсулина (0.5 мкг/мл) ("Sigma", США). Плотные культуры с близко расположенными клетками получали при введении в чашку Петри над стеклами, покрытыми коллагеном, суспензии изолированных гепатоцитов (около 106 клеток/мл). Разреженные культуры получали из той же суспензии клеток, разведенной примерно в 10 раз. Через 2 ч стекла с прикрепившимися клетками отмывали и оставляли в термостате еще на 1 сут, затем еще раз отмывали и начинали исследова-
ния. В течение 2 ч последовательно через каждые 10 мин брали пробы — каждую по три культуры. В каждой культуре измеряли включение 3Н-лейцина в белки за 10 мин и пул свободного меченого лейцина в той же культуре — в белковой и кислотораствори-мой фракциях соответственно. Относительное включение лейцина 1С0ГГ, характеризующее интенсивность синтеза белка, рассчитывали по формуле:
1С0ГГ = I х Р^/Р (импульс/мин), где I — включение лейцина в белки за 10 мин в одной определенной культуре; Р! — общая радиоактивность той же культуры (Р. = I + р,, где р 1 — пул свободного меченого лейцина в клетках той же культуры), — средняя радиоактивность культур определенного опыта — среднее из Р всех точек опыта (например, для 2-часового опыта — среднее для 36 культур). Таким образом, формула характеризует измеренное включение лейцина в белки клеток определенной культуры по отношению к доле общей радиоактивности этой культуры (включение плюс пул невклю-чившегося меченого лейцина) к средней радиоактивности всех культур данного опыта. Поскольку величины числителя I и знаменателя Р уравнения для каждой культуры зависят от одного и того же числа клеток, в формуле 1С0ГГ вводится поправка на число клеток в разных культурах, а также на варьирующий пул. Очевидно, что введение постоянного для каждого опыта множителя не изменяет рисунка кривой, но позволяет выразить относительное включение лейцина в общепринятых единицах имп/мин, а не в процентах I от Р..
Мелатонин (мелаксен) в физиологическом растворе объемом 0.5 мл вводили крысам внутрибрю-шинно. Предварительно было показано, что для синхронизирующего синтез белка действия мелато-нина минимальное время между инъекцией мелато-нина и изоляцией гепатоцитов составляет 1 ч 40 мин, эти данные использовали в последующих опытах. Каждый опыт проводили на гепатоцитах одной и той же крысы.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Исследовали плотные культуры гепатоцитов с близко расположенными клетками и разреженные культуры, полученные из суспензий с разной концентрацией гепатоцитов одной и той же крысы. Как показано в десятках наших опытов (см. обзор: Бгоё-8ку, 2006), колебания интенсивности синтеза белка в плотных культурах быстро самосинхронизируются после смены среды, и в таких культурах практически сразу же после этого наблюдают околочасовой ритм синтеза белка. В разреженных культурах клетки отстоят далеко друг от друга. Многократно показано, что в разреженных культурах после смены среды ритм не выявляется в течение 2-4 ч наблюдений. Можно было ожидать, что до введения крысам мела-тонина в плотных культурах ритм синтеза белка есть,
а в разреженных - нет. Однако на поведение клеток могла влиять сама инъекция раствора животному. Поэтому в качестве контроля приняли введение крысе 0.5 мл физиологического раствора, который использовали в остальных опытах для растворения мелатонина. Через 1 ч 40 мин после инъекции выделяли гепатоциты и культивировали их in vitro, через 1 сут культуры отмывали. В разреженных культурах в свежей среде ритма синтеза белка не выявили (рис. 1). Таким образом, сама инъекция не синхронизирует клетки; ритм синтеза белка не появляется. После добавления в среду с такими культурами 2 нМ мелатонина наблюдали ритм, т.е. такие культуры способны синхронизироваться мелатонином. В плотных культурах был обнаружен ритм синтеза, что также соответствует многим нашим наблюдениям о свойствах интактных плотных культур.
В опыте, результаты которого приведены на рис. 2, изучали влияние мелатонина, введенного внутрибрюшинно молодой крысе (вес 280 г), на кинетику синтеза белка в гепатоцитах разреженных культур. Доза мелатонина в этом случае составляла 0.012 мкг/кг веса крысы. В суточных отмытых культурах обнаружили ритм синтеза белка. Следовательно, введенный крысе мелатонин накапливается в печени и синхронизирует гепатоциты до их изоляции. Добавление в среду с такими суточными культурами мелатонина (5 нМ) не изменяло кинетику синтеза белка.
Следующие серии опытов проводили на старых (2-2.5-летних весом 550—650 г) крысах. Исследовали как разреженные, так и плотные культуры. Плотные культуры гепатоцитов интактных крыс, как показано нами ранее, самосинхронизируются вскоре после смены среды. Также ранее было показано, что амплитуда ритма в гепатоцитах старых крыс в среднем вдвое ниже, чем у молодых (Бродский и др., 2005). Амплитуду рассчитывали как разницу между максимумами и минимумами кривой в процентах от среднего уровня синтеза белка для определенного опыта. Величина амплитуды, как известно, характеризует синхронизацию колебаний скорости синтеза белка. Чем больше амплитуда ритма, тем значительнее синхронизация колебаний скорости синтеза белка (или любого другого ритма) в индивидуальных клетках. В несинхронных культурах из-за сложения максимумов и минимумов колебаний в индивидуальных клетках в сумме кинетика линейная. По нашим предыдущим данным, амплитуда ритма синтеза белка в плотных культурах интактных старых крыс, не испытавших каких-либо внешних воздействий, была в среднем около 23%, а максимальной у единичных особей — 40% от среднего уровня синтеза белка.
Мелатонин (0.013 мкг/кг веса крысы) вводили также старой крысе (рис. 3). Введение его (5 нМ) в среду с суточными плотными культурами не повышало средний уровень синтеза белка. Средняя амплитуда ритма синтеза белка составляла в этом слу-
МЕЛАТОНИН, ВВЕДЕННЫЙ КРЫСЕ, ЭФФЕКТИВНО СИНХРОНИЗИРУЕТ РИТМ
103
чае (рис. 3) в плотных культурах около 70%, т.е. была значительно выше максимальных значений в клетках интактных старых крыс. В разреженных культурах гепатоцитов той же крысы наблюдали четкий ритм синтеза белка.
Как долго сохраняется в культуре синхронизирующий эффект мелатонина после однократного введения его крысе? Чтобы выснить это, исследовали кинетику синтеза белка через 1 и 2 сут после инъекции мелатонина (0.015 мкг/кг веса старой крысы) и культивирования гепатоцитов (рис. 4). В течение 2 сут культуры оставались синхронными, в них выявлялся ритм синтеза белка. На 2-е сут средний уровень синтеза белка был даже несколько выше, чем через 1 сут после введения мелатонина крысе. И в плотных, и в разреженных культурах наблюдали ритм синтеза белка, что характеризует кооперацию клеток в организации популяционного ритма синтеза белка. Амплитуда ритма в плотных культурах была в среднем 56%, т.е. значительно выше, чем в интактных культурах старых крыс.
В следующих опытах выясняли: сохраняется ли синхронизирующее действие мелатонина в течение
1 сут в случае, если ввести мелатонин за 1 сут до изоляции клеток. Старой крысе вводили внутрибрю-шинно мелатонин
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.