БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2007, том 24, № 2, с. 183-192
УДК 577352
МЕМБРАННЫЕ НАНОТРУБКИ В ЭЛЕКТРИЧЕСКОМ ПОЛЕ КАК СИСТЕМА ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ МЕХАНИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ
ЛИПИДНОГО БИСЛОЯ
© 2007 г. П. В. Башкиров
Институт физической химии и электрохимии им. АН. Фрумкина РАН, 119991 Москва, Ленинский проспект, д. 31, стр. 5; электронная почта: pashokb81@mail.ru
Поступила в редакцию 26.10.2006 г.
Предложен метод измерения механических параметров сильно изогнутого липидного бислоя, основанный на анализе ионной проводимости мембранной нанотрубки (НТ), сформированной из плоской бислойной липидной мембраны (БЛМ), в растворе электролита. НТ вытягивали из БЛМ с помощью пэтч-пипетки, одновременно используемой для измерения проводимости НТ в режиме фиксации потенциала. Гиперболическая зависимость проводимости НТ от изменения ее длины свидетельствовала о цилиндрической форме сформированных НТ. Равновесный радиус НТ, найденный из гиперболической аппроксимации, составлял от 2 до 20 нм в зависимости от липидного состава БЛМ. Показано, что радиус НТ растет с увеличением напряжения, что связано с уменьшением эффективного латерального натяжения мембраны НТ согласно уравнению электрокапиллярности Липпмана. Теоретическая аппроксимация полученной зависимости, основанная на модифицированной формуле Хельфриха для стационарного радиуса мембранного цилиндра, позволила определить модуль изгиба k и латеральное натяжение о мембраны НТ в предположении, что отклонение формы НТ от цилиндрической при использованных напряжениях мало. Полученные значения модуля изгиба фосфолипидной мембраны находятся в согласии с литературными данными.
Механические и термодинамические свойства биологических мембран определяют важнейшие процессы жизнедеятельности клеток. Однако вследствие сложности устройства мембран даже простейших клеток, детальное определение этих свойств представляется трудноразрешимой задачей. Поэтому за последние десятилетия существенная часть исследований в этой области была посвящена изучению свойств фосфолипидной мембраны - фундаментальной структурной единицы любой биологической мембраны. При этом большое внимание уделено мембранам цилиндрической формы, так называемым мембранным трубкам. Связано это с тем, что многие клеточные процессы, например, такие как эндоцитоз и клеточное слияние, сопряжены с формированием мембранных трубок. Гипотеза, предполагающая формирование таких трубок в процессе эндоцитоза была предложена в работе [1]. Позже было показано [2], что в некоторых случаях в процессе эндоцитоза везикула не претерпевает полного отделения от цитоплазматиче-ской мембраны, а остается связанной с ней тонкой (~20 нм) мембранной нанотрубкой (НТ). Мембранные нанотрубки, наряду с везикулами, играют существенную роль во внутриклеточном и межклеточном транспорте [3, 4]. В ряде клеточных и искусственных систем было показано, что мембранные трубки образуют разветвленную транспортную сеть, в формировании которой могут участвовать белковые "моторы" [5, 6]. Как механизмы форми-
рования, так и поведение мембранных трубок определяются свойствами липидного бислоя. В связи с этим большое количество работ посвящено изучению липидных мембранных трубок in vitro [7-10]. В литературе такие трубки получили название мембранные нити (МН), или тетеры, от английского слова "tether" [11, 12].
Для описания формирования структур, обладающих цилиндрической симметрией, а также анализа их стабильности в ряде липидных мембранных систем используют параметрические модели, оперирующие следующими фундаментальными параметрами липидного бислоя: его латеральным натяжением а и модулем изгиба к [13, 14]. В случае мембранного цилиндра значение его равновесного радиуса, как было показано в работе [13], находится из соотношения:
Г ца'
(1)
Хотя для решения общей задачи о нахождении равновесной формы липидного бислоя кроме латерального натяжения и модуля изгиба необходимо учитывать другие параметры мембраны [11, 15], важно, что даже использование двухпарамет-рического приближения (1) позволяет предсказывать поведение мембранной трубки в различных экспериментальных системах [7, 8, 16]. Анализ стационарной геометрии бислоя цилиндрической
формы, согласно формуле Хельфриха, уравнение (1) дает возможность определять значения его механических параметров. Например, измерение радиуса цилиндра, вытянутого из мембраны с заданным натяжением, позволяет найти ее модуль изгиба, что является одним из основных методов определения модуля изгиба липидных бислоев в настоящее время [17-19]. Кроме того, такой феноменологический подход к анализу формы мембраны широко используется при работе с клеточными системами. В частности, трансформации клеточных отростков [16, 20] хорошо описываются с помощью формализма, разработанного для описания липидных трубок. Важно, что экспериментальные методы измерения механических параметров липидного бислоя были использованы и в клеточных системах [12, 21-23]. Здесь, ввиду сложности устройства мембраны, анализ закономерностей формирования мембранной трубки дает возможность найти не только модуль изгиба мембраны, но и ее энергию взаимодействия с цитоскелетом [24, 25] и другие важные параметры [11].
Однако существующие экспериментальные методы исследования мембранных трубок обладают рядом недостатков. Во-первых, оптические методы наблюдения не позволяют ответить на вопрос о быстрых изменениях формы трубок ввиду их ограниченной временной и пространственной чувствительности. Во-вторых, геометрический размер трубок, получаемых в липидных системах, составляет десятки, а иногда и сотни нанометров, что значительно превышает размеры клеточных аналогов [10-12, 16-18]. Поэтому возникает вопрос о применимости экспериментальных подходов, использовавшихся ранее в липидных системах, для описания тонких мембранных трубок, радиус кривизны которых сравним с толщиной мембраны.
Недавно в нашей лаборатории была разработана система, позволяющая исследовать мембранные трубки малого размера [8]. Другой важной особенностью этой системы является возможность исследования влияния трансмембранного напряжения на динамику липидной трубки. В клеточных системах изменения формы мембраны часто сопряжены с электрической активностью, при этом влияние трансмембранного напряжения на поведение липидного бислоя изучено недостаточно. Данная работа посвящена исследованию НТ, получаемых предложенным ранее методом, а также их использованию для изучения свойств фос-фолипидных мембран. Описана и реализована процедура определения радиуса НТ различного липидного состава. Предложен новый метод измерения модуля изгиба липидного бислоя, основанный на приложении электрического поля вдоль НТ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Формирование мембраны. Бислойную липид-ную мембрану (БЛМ) формировали по методу Ру-дина-Мюллера на 100 мкм отверстии в тефлоно-вой пленке, разделяющей два отсека специальной ячейки, заполненной электролитом (0.1 мМ KCl, 10 мМ HEPES, pH 7.0). Для формирования БЛМ использовался раствор фосфолипидов ("Avanti Polar Lipids Inc.", США) в сквалане ("Sigma", США) в концентрации 10 мг/мл. Использовали 1,2-диолеоил-.от-глицеро-3-фосфохолин (ДОФХ), 1-олеоил-2-гид-рокси-.от-глицеро-3-фосфохолин (ОФХ), 1,2-дио-леоил-.от-глицеро-3-фосфоэтаноламин (ДОФЭ) и холестерин в соотношениях, указанных в тексте.
Формирование мембранных трубок. Для формирования и исследования электрических свойств мембран и мембранных трубок использовали установку (рис.1), состоящую из пэтч-пипетки, универсального генератора PAR-175 ("Princeton Applied Research", США), пэтч-кламп усилителя EPC-7 ("Heka", Германия), четырехполюсного фильтра F-900 ("Frequency Devices", США) и осциллографа 0S-1420 ("GOULD", Англия). Для контроля положения пипетки использовали контроллеры движения "Newport" Motion Controller (Model 860-C2) и пьезоконтроллер "Newport" ц-Drive Controller (Model ESA-CSA), последний для высокоточного (шаг 50 нм) перемещения по вертикали.
В процессе формирования БЛМ на хлорсереб-ряные электроды посредством пэтч-кламп усилителя подавался пилообразный сигнал с генератора и измерялся емкостной ток мембраны в режиме фиксации потенциала. Процесс образования липидного бислоя фиксировался по резкому увеличению емкости и одновременно по исчезновению изображения в микроскопе (толщина БЛМ ~4 нм -много меньше длины волны видимого света). Затем с помощью микроманипулятора к мембране подводили пэтч-пипетку, так что между кончиком микропипетки и мембраной формировался плотный контакт (сопротивление контакта 1-10 ГОм) (рис. 16), что было видно по исчезновению емкостного тока. Для разрушения мембраны под пипеткой скачком менялось гидростатическое давление, что приводило к появлению тока проводимости. После этого пипетка отводилась от плоской мембраны, вытягивая мембранную трубку (рис. 1 в,г). Затем к электродам прикладывали постоянную разность потенциалов и измеряли ток проводимости через мембранную трубку. Изменение длины трубки осуществлялось с помощью пьезоконтрол-лера, для которого была построена калибровочная кривая, связывающая показания индикатора пьезоконтроллера с изменением положения пипетки в вертикальном направлении. Нормированные показания индикатора (L), соответствующие величине вертикального смещения пипетки относительно низшего возможного положения, а так-
микроконтроллер движения
Рис. 1. Схема формирования мембранной нанотрубки: а - исходная плоская бислойная липидная мембрана (БЛМ); б -формирование плотного контакта между пэтч-пипеткой и БЛМ с последующим разрушением мембраны под пипеткой; в - формирование мембранной катеноидальной микротрубки (МТ) в начале отведения пипетки от плоской БЛМ; г - образование мембранной нанотрубки (НТ) в результате коллапса МТ при достижении критической длины.
же ток через мембранную трубку и значения приложенного потенциала записывали на жесткий диск компьютера с помощью АЦП Ь-305/Ь-1210 ("Ь-саМ", Россия). Частота опроса 1кГц. Перед вводом в компьютер сигналы пропускали через фильтр низких частот ^-900); частота среза 0.5 кГц.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Определение радиуса мембранной нанотрубки. Вначале были исс
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.