УСПЕХИ СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ, 2012, том 132, № 4, с. 391-400
УДК 577.352.4
МЕМБРАННЫЕ ПЕРЕНОСЧИКИ АМИНОКИСЛОТЫ ГЛИЦИН В НЕРВНОЙ ТКАНИ: СТРУКТУРА, ЛОКАЛИЗАЦИЯ, ОСНОВНЫЕ ФУНКЦИИ И РЕГУЛЯЦИЯ
© 2012 г. К.С. Зайцев, Е.В. Машковцева, Я.Р. Нарциссов
Научно-исследовательский институт цитохимии и молекулярной фармакологии, Москва
E-mail: zaytsev.k.s@gmail.com
Аминокислота глицин является не только одним из наиболее распространенных компонентов белков, но и выступает в роли тормозного нейромедиатора в головном и спинном мозге. Эта функция, состоящая в активации специфичных лиганд-зависимых хлорных каналов, представляет собой важнейший аспект работы нервной системы млекопитающих. Поскольку передача торможения между нейронами, организованная в виде специализированных синапсов, подразумевает возобновление пула нейромедиаторов, то мембранные транспортные системы играют существенную роль в регуляции активности как отдельных нейронов, так и всей нервной ткани в целом. Данный обзор посвящен подробному описанию семейства глициновых переносчиков (GLYT), которые осуществляют обратный захват глицина из синаптической щели. Приводится описание структуры транспортеров. Отмечается возможное снижение активности GLYT в условиях ацидоза и возникновение реверсивного выброса метаболита при изменении направления градиента концентрации ионов натрия на мембране. Обсуждается возможная роль данных феноменов в физиологических и патологических условиях.
Ключевые слова: глицин, глициновый переносчик, нейроны, нейромедиатор, нервная ткань.
ВВЕДЕНИЕ
Глицин (аминоуксусная кислота) является одним из основных ингибирующих нейроме-диаторов центральной нервной системы (ЦНС). В спинном мозге и стволе мозга он участвует в различной двигательной и сенсорной деятельности [40]. Глицин-зависимая нейропередача включает в себя хранение глицина в пресинаптических везикулах, высвобождение его в ходе деполяризации нейрона, связывание аминоуксусной кислоты с лиганд-зависимым ионоторопным рецептором постсинаптической мембраны и последующий обратный транспорт медиатора из синаптической щели (рис. 1).
Большинство белков, локализованных в преси-наптической области глицинергического синапса, предназначены для упаковки и/или повторного использования глицина. Упаковка глицина заключается в его концентрировании в синаптических везикулах. Центральную роль в этом процессе играет белок VIAAT (Vesicular Inhibitory Amino Acid Transporter - везикулярный переносчик тормозных аминокислот), использующий протонный градиент для транспорта нейромедиатора в синаптические везикулы [11]. Концентрация ами-
ноуксусной кислоты в синаптических везикулах достаточно высока и достигает миллимолярного уровня.
Глициновые рецепторы расположены на постсинаптической мембране. Данный тип рецепторов наряду с ГАМК рецепторами играет ключевую роль в регуляции торможения. Глициновый рецептор относится к классу ионотропных рецепторов, скорость действия которых составляет миллисекунды [8]. В структуре быстродействующих рецепторов можно выделить ионный канал, открывающийся при связывании медиатора. In vivo он содержит в себе пять субъединиц, которые расположены псевд о симметрично вокруг селективной ионной поры, в стехиометрическом соотношении 3а:2р [34]. Взаимодействие нейро-медиатора с глициновыми рецепторами приводит к открытию хлорных каналов [51], гиперполяризации мембраны и распространению торможения [16].
После того, как происходит высвобождение глицина из пресинаптической области в синапти-ческую щель, запускаются несколько механизмов глицинового захвата. В плазматической мембране аксонного окончания экспрессируется нейрональ-
Рис. 1. Схема глицинергического синапса. VIAAT - везикулярный переносчик аминокислот, SSV - маленькие синаптиче-ские везикулы, GLYR - глициновый рецептор, GLYT1 - глициновый переносчик типа 1, GLYT2 - глициновый переносчик типа 2.
ный GLYT2 (GLYcine Transporter 2 - глициновый переносчик 2 типа). GLYT2 осуществляет перенос глицина в аксонную терминаль параллельно с котранспортом ионов Na+ и Cl- [12]. Именно GLYT2 играет ключевую роль в поглощении глицина в пресинаптическое окончание.
В глиальных клетках представлен глициновый переносчик 1 типа (GLYT1), который регулирует количество глицина, доступного для связывания с глициновым рецептором [13].
СТРУКТУРА, ЛОКАЛИЗАЦИЯ И ОСНОВНЫЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ГЛИЦИНОВОГО ПЕРЕНОСЧИКА
Синаптическое действие глицина заканчивается захватом нейромедиатора специфическими белками нейрональных и глиальных плазматических мембран, имеющими к нему высокую степень сродства [38]. Захват глицина - это пример вторичного активного транспорта, осуществляемого переносчиком при наличии электрохимического градиента ионов натрия. Более того, при деполяризации синаптического окончания и увеличении внутриклеточной концентрации Na+, глициновый переносчик может функционировать и в обратном направлении, транспортируя нейромедиатор из клетки посредством Са2+-независимого механизма высвобождения [3].
Типы глициновых переносчиков
Высокое сродство активных транспортных систем к глицину (Km 20-100 мкМ) в нервных окончаниях и глиальных клетках было установлено в различных исследованиях, в том числе проведенных на препаратах мозга [14,56]. Также были обнаружены зависимость процесса переноса данной аминокислоты от ионов Na+ и Cl-, наличие стехиометрических соотношений транспортируемых молекул и электрогенность [4]. При изучении препарата, выделенного из мозга свиньи, было непосредственно показано существование нескольких подтипов глицинового переносчика, по-разному ингибируемых саркозином (N-метил-глицином). Выделенный в 1991 г. [28] подтип получил впоследствии название GLYT2. Около 30% молекулярной массы этого белка (100 кДа) составляют цепочки сахаров, которые представляют собой три- или тетра-антеннальный комплекс олигосахаридов, содержащих остатки сиаловой кислоты.
Были клонированы два гена, кодирующие глициновые переносчики GLYT1 и GLYT2 [23]. Сходство аминокислотной последовательности нейромедиаторного транспортера GLYT1 и ГАМК переносчика типа 1 GAT1 (Gamma-aminobutyric Acid Transporter - переносчик гамма-аминомас-ляной кислоты - ГАМК) позволило осуществить его клонирование [53].
Оба транспортера принадлежат к семейству №+/С1"-зависимых нейромедиаторных транспортных белков SLC6, которые включают переносчики ГАМК, глицина, пролина и моноаминов. Обнаружено, что GLYT1 кодируется геном SLC6A9, а GLYT2 - геном SLC6A5. Была показана различная их чувствительность к саркозину, который взаимодействовал с GLYT1, но не с GLYT2 [53].
Ген GLYT1 человека локализован в хромосоме 1р31.3 [26]. Были идентифицированы 5 вариантов белка GLYT1 (а,Ь,е,е,/), полученные путем комбинирования N и С-терминальных экзонов [2]. Варианты, содержащие е экзон, кодирующий С-конец, были обнаружены только в сетчатке глаза. Человеческий ген GLYT2 был локализован в хромосоме 11р15.1-15.2 [15,37]. В мозге крыс были обнаружены 2 типа белка GLYT2a и GLYT2b, отличающиеся аминокислотными последовательностями ^концов, которые синтезируются в результате различных вариантов сплайсинга [9,10].
Однако рентгеноструктурные данные для переносчика из млекопитающих до сих пор не получены [6], и для структурного анализа и описания глицинового транспортера используется рёЬ-структура его бактериального гомолога LEUTAA (рёЬ 2а65, www.pdb.org). Глициновый транспортер представляет собой мембранный белок с 12 трансмембранными доменами, N и С-концы которого ориентированы внутрь клетки (рис. 2) [41]. Такое расположение приводит к тому, что сайты гликозилирования находятся на внешней поверхности клетки, а несколько потенциальных сайтов фосфорилирования киназ - с внутренней стороны мембраны. Нуклеотидные последовательности GLYT1b и GLYT2a (наиболее изученные подтипы глицинового транспортера) содержат 638 и 799 аминокислотных остатков, соответственно [29,37]. Наиболее консервативные участки формируют трансмембранные домены, а наименьшее сходство свойственно N и С- концам. Большая внеклеточная петля глицинового переносчика, соединяющая 3 и 4 трансмембранные домены, содержит 4 ^гликозилированных сайта. Аминокислотные последовательности GLYT1 и GLYT2 на 48% и 50% соответственно совпадают с последовательностью пролинового транспортера.
Для исследования функциональной мономерной природы глицинового переносчика использовались два различных экспериментальных подхода: гель-фильтрационная хроматография и Н20/Э20 центрифугирование в градиенте плотности сахарозы. Гидродинамические свойства очищенного нативного GLYT2 оказались сопоставимы со свойствами функционального белка весом
Внеклеточное пространство
NHj
СОО"
Внутриклеточное пространство
Внеклеточное пространство
Внутриклеточное пространство
Рис. 2. Топографическая схема размещения глициновых переносчиков GLYT1 (а) и GLYT2 (б) в мембране клеток.
85-100 кДа, что дало возможность предположить, что нативный транспортер работает как мономерный белок [29]. GLYT1 же имеет молекулярную массу 50-70 кДа [32]. C помощью электрофореза и метода глутаральдегидных сшивок было показано, что поверхностно локализованные транспортеры, по-видимому, существуют только в гли-козилированных мономерных формах [24].
Локализация глициновых переносчиков
Экспрессия глицинового транспортера в клетках и тканях протекает параллельно с комплексной глициновой активностью, описанной ранее. В ряде исследований, использующих технику гибридизации in situ и иммуноцитохимические методы, были определены популяции клеток, экспрессирующих GLYT мРНК и белок [2,9]. GLYT2 преимущественно обнаруживают в пре-синаптической мембране, GLYT1 же - в глиаль-ных клетках (рис. 1). Показано одновременное наличие GLYT1 и GLYT2, а также экспрессия соответствующих мРНК в мозжечке и спинном мозге, что свидетельствует о явной связи обоих белков с ингибирующей глицинергической ней-ропередачей [57]. GLYT1 присутствует также в других областях, лишенных глициновых рецепторов, таких как промежуточный мозг, сетчатка, обонятельная луковица и полушария головного мозга, что подтверждает его участие в контро-
ле л
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.