ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2014, том 61, № 4, с. 466-475
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
МЕМБРАННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ ЦИТОКИНИНА И ИХ РЕГУЛЯТОРНАЯ РОЛЬ В РЕАКЦИИ РАСТЕНИЙ Arabidopsis thaliana НА ФОТООКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС В УСЛОВИЯХ ВОДНОГО ДЕФИЦИТА
© 2014 г. М. Н. Данилова*, Н. В. Кудрякова*, П. Ю. Воронин*, Р. Оельмюллер**,
В. В. Кузнецов*, О. Н. Кулаева*
*Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва **Институт общей ботаники и физиологии растений, Йенский университет, Йена, Германия
Поступила в редакцию 30.12.2013 г.
Комбинированный мягкий фотоокислительный стресс на фоне дефицита влаги вызывал изменение экспрессии генов трансдукции сигнала цитокинина (ЦК). Согласно данным ПЦР-РВ под действием этих стрессовых факторов подавлялось накопление транскриптов генов-рецепторов ЦК АНК2 и АНК3 и гена регулятора ответа ARR5 и незначительно возрастал уровень транскриптов гена АНК4. Отсутствие активных рецепторов АНК2 и АНК3 у мутантов Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. оказывало существенное влияние на содержание низкомолекулярных антиоксидантов (антоциа-нов, каротиноидов, пролина) и приводило к ЦК-зависимому изменению экспрессии генов-маркеров окислительного стресса, в том числе RAB18, CHS, P5CS1 и PRODH1, как в условиях действия стрессового фактора, так и в норме. Вместе с тем выключение любого из генов рецепторных гисти-динкиназ или их комбинации не вызывало ЦК-специфичных изменений в уровне стресс-активи-руемой экспрессии маркера окислительного стресса AOX1a. У мутантов по генам рецепторов ЦК не выявлено статистически достоверного влияния генотипа на выход флуоресценции ФС II и ФС I в норме и при действии стрессового фактора, но показано участие системы рецепции ЦК в изменении уровней транскриптов генов белков фотосинтетического аппарата ELIP2 и PSBS. Таким образом, ЦК играют важную роль в реакции растений на фотоокислительный стресс. При этом одной из основных стратегий приспособления Arabidopsis к избыточному освещению на фоне дефицита влаги является инактивация компонентов сигналинга ЦК.
Ключевые слова: Arabidopsis thaliana — цитокинины — гистидиновые протеинкиназы — окислительный стресс — ПЦР-РВ — экспрессия генов
DOI: 10.7868/S001533031404006X
ВВЕДЕНИЕ
В ходе эволюции у растений сформировались сложные механизмы ответа на внешние стрессовые сигналы, которые воспринимаются с помощью разнообразных рецепторных молекул и передаются по сигнальным системам в ядро и, возможно, в другие органеллы клетки, вызывая
Сокращения: ДТ — дикий тип; ПЦР-РВ — полимеразная цепная реакция в реальном времени; ТБК-АП — комплекс тио-барбитуровой кислоты и взаимодействующих с ней активных продуктов; ЦК — цитокинины; AHK — гистидиновая протеинкиназа (от Arabidopsis Histidine Kinase); ARRB — транскрипционный фактор (от Arabidopsis Response Regulator, тип B).
Адрес для корреспонденции: Кудрякова Наталия Васильевна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Электронная почта: nkudryakova@rambler.ru
изменение экспрессии генов, необходимых для адаптации к новым условиям. Важная роль в процессе формирования устойчивости растений к стрессам принадлежит фитогормонам, прежде всего абсцизовой и салициловой кислотам, способным активировать транскрипцию пула стресс-индуцибельных генов. Наряду с этими фитогор-монами в ответе растений на неблагоприятные условия среды принимают участие и цитокинины (ЦК) [1]. Цепь рецепции и трансдукции цитоки-нинового сигнала у Arabidopsis thaliana включает мембранные гистидиновые протеинкиназы — AHK (от Arabidopsis Histidine Kinase) [2—4], которые воспринимают ЦК сигнал и передают его через фосфатный каскад в ядро специфичным транскрипционным факторам ARR типа B (ARRB) [5]. Они, в свою очередь, регулируют экспрессию
разнообразных генов. Такая двухкомпонентная сигнальная система включает также регуляторы ответа типа А, которые, подобно ЛЯЯБ, способны воспринимать активированный фосфат с фос-фотрансмиттеров и снижать уровень ЦК-индуци-руемой транскрипции.
Данная сигнальная система вовлекается в контроль ЦК многих морфофизиологических программ, включая ответ на абиотические стрессы [1]. Так, например, анализ данных микрочипов показал дифференциальную регуляцию генов, кодирующих белки сигналинга ЦК холодовым, солевым и осмотическим стрессами [6]. Холодо-вой стресс вызывал повышение экспрессии генов регуляторов ответа типа А и подавление экспрессии генов всех трех мембранных рецепторов ЦК [1], а осмотический и солевой стрессы способствовали подавлению экспрессии генов AHK2 и AHK4 в корнях и побегах и увеличению экспрессии гена AHK3 [7]. Засуха активировала экспрессию генов AHK2 и AHK3 [8] и подавляла экспрессию всех трех генов фосфотрансмиттеров цито-кининового сигнала: AHP2, AHP3 и AHP5 [9]. Таким образом, изменение экспрессии генов сиг-налинга ЦК может играть важную роль в ответной реакции растения на стресс.
В литературе отсутствуют сведения о возможном участии ЦК в реакции на фотоокислительный стресс, приводящей к деструкции фотосинтетического аппарата под действием активных форм кислорода. Однако существование фотопротекторного действия этого фитогормона представляется весьма вероятным, так как известно, что ЦК способен активировать экспрессию генов биосинтеза глютаредоксинов и флаво-ноида антоциана [6], обладающих фотопротекторными функциями. Показана взаимосвязь между сигнальными цепями цитокининов и криптохромами, осуществляющими восприятие светового сигнала в синей части спектра; точкой пересечения обеих сигнальных цепей является транскрипционный фактор ИУ5, который способен регулировать накопление антоцианов, связываясь с промоторами генов биосинтеза этого пигмента [10].
Цель данной работы заключалась в изучении роли гистидиновых киназ — мембранных рецепторов ЦК в реакции растения на фотоокислительный стресс. При этом в качестве модели для исследования был избран комбинированный мягкий световой стресс на фоне засухи [11], воссоздающий условия формирования защитного ответа организма, приближенные к реально встречающимся в природе.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал и схема опыта. Исследования проводили на листьях одинарных и двойных инсерционных мутантов Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. с инактивированными генами, кодирующими мембранные рецепторы ЦК (ahk2, ahk3, ahk4, ahk2ahk3, ahk2ahk4, ahk3ahk4), а также на трансформантах A. thaliana, включающих бактериальный ген Р-глюкуронидазы под контролем промотора гена регулятора ответа типа А (parrtgus) или промоторов генов одной из трех гистидиновых протеинкиназ (phk2-gus, PHK3-GUS и PAHK4-GUS). Семена были любезно предоставлены профессорами С. Nishimura (университет Нагойи, Япония) и J.J. Kieber (университет Северной Каролины, США).
Растения выращивали в климатической камере в почве при температуре 23°C и освещенности 100 мкЕ/(м2 с). Продолжительность светового периода составляла 16 ч. Для создания режима мягкого светового стресса на фоне недостатка влаги использовали постановку экспериментов, разработанную Giraud с соавт. [11]: 4-недельные растения через 4 дня после прекращения полива переносили в условия повышенной круглосуточной освещенности (250 мкЕ/(м2 с)) и выдерживали еще трое суток.
Физиологические показатели стресса. Определение содержания пролина проводили по методу Bates с соавт. [12]. Содержание малонового диаль-дегида (МДА) оценивали по окрашенному комплексу ТБК с конечными продуктами окисления липидов, образующемуся при нагревании (ТБК-тест) [13]. Содержание хлорофиллов после экстракции 80% ацетоном измеряли согласно методике Vernon [14]. Накопление антоцианов и относительное содержание воды оценивали в соответствии с протоколами Giraud с соавт. [11].
Относительное содержание воды рассчитывали по формуле:
(FW - DW)/(TW - DW) х 100%,
где FW — сырой вес листьев, DW — сухой вес листьев, TW — вес листьев в состоянии тургора.
Измерение выхода флуоресценции. Для определения выхода флуоресценции ФС II и ФС I использовали метод определения частотно модулированной флуоресценции с помощью прибора PAM 101 ("Walz", Германия), в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя [15].
Измерение активности p-глюкуронидазы. Измерение активности Р-глюкуронидазы у трансгенных растений A. thaliana проводили флюоро-метрическим методом, описанным ранее [16], с помощью флюориметра Hoefer DyNA Quant 200 ("Amersham Biosciences", Великобритания).
Таблица 1. Список последовательностей ген-специфичных праймеров
Ген Локус Последовательность праймеров 5' ^ 3'
AHK2 AT5G35750 TGTCCAGGGAATGGGAAGTT GGGGATATAAGTGAGCAGCATATAA
AHK3 AT1G27320 GCATCGGAGCTTTGAACCAT GGATATGGATGGTCCGACTTG
AHK4 AT2G01830 ATTCTAGCGATGACTGCGGA CGACGAAGGTGAGATAGGATT
ARR5 AT3G48100 CTACTCGCAGCTAAAACGC GCCGAAAGAATCAGGACA
AOX1a AT3G22370 GATTGGAGGTATGAGATTCGC CGGTGGATTCGTTCTCTGTTTT
CHS AT5G13930 CGTGTTGAGCGAGTATGGAA CTCCAACCCTTCTCCTGTCG
P5CS1 AT2G39800 CGTGATCCTCTGTCACAATGC CCAGAAGCACGGTCATTCAAC
PRODH1 AT3G30775 GAGACTTGCGTCGAGGAAAG GCTAACATTGAACCCTGCTCTC
ELIP2 AT4G14690 ACGGGAGACTAGCAATGGTT CCTAGAAACCACCCGACACC
PSBS AT1G44575 TTGCTTGGTGAGGCGTTGAC GGCTCTGCTTCGTAAATCGG
RAB18 At5g66400 TCGCATTCGGTCGTTGTATTGT AGTAAACAACACACATCGCAGGA
UBQ10 At4g05320 GCGTCTTCGTGGTGGTTTCTAA GAAAGAGATAACAGGAACGGAAACA
Относительный количественный анализ экспрессии генов. Суммарную РНК выделяли с применением реагента TRIzol ("Invitrogen", США) в соответствии с рекомендациями производителя (http://www.invitrogen.com). Препарат РНК обрабатывали ДНКазой I, свободной от РНКаз ("Fermentas", Литва). Синтез кДНК проводили с помощью обратной транскриптазы RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase ("Fermentas"), используя олиго-д(Т)20 праймеры ("ДНК-синтез", Россия). Относительный уровень экспрессии генов оценивали методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) после обратной транскрипции с использованием готовой реакционной смеси, содержащей флуоресцентный краситель SYBR Green I ("Евроген", Россия) на приборе ABI 7500 Fast ('Applied Biosystems", США). По окончании амплификации для подт
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.