УДК 612.816;612.014.423
МЕМБРАННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ НЕЙРОНОВ ТАЛАМУСА НОВОРОЖДЕННЫХ КРЫСЯТ
© 2013 г. А. В. Яковлев1, К. С. Королева1, Ф. Ф. Валиуллина1, Р. Н. Хазипов12*
1Казанский федеральный университет, лаборатория нейробиологии, 420008, Казань, ул. Кремлевская 18, Россия 2Институт нейробиологии Средиземноморья, INSERM U901, 163 ав. Люмини, 13273 Марсель, Франция;
*электронная почта: roustem.khazipov@inserm.fr Поступила в редакцию 22.02.2013 г.
Мембранный потенциал покоя — фундаментальный параметр, определяющий функциональные свойства нейронов. Нейроны таламуса функционируют в режиме вспышечной или тонической активности в зависимости от их мембранного потенциала, что определяет способ передачи сенсорной информации через таламус от сенсорного органа в кору головного мозга, а также генерацию различных типов активности в таламокортикальных сетях. Считается, что у новорожденных крысят нейроны таламуса деполяризованы (значения мембранного потенциала около —50 мВ) и, следовательно, находятся в состоянии постоянной тонической активности. Однако эти данные получены при регистрации нейронов таламуса с помощью пэтч-кламп-регистрации в конфигурации "целая клетка" (whole-cell), при которой, как известно, возможна искусственная деполяризация клеток в результате шунтирования мембраны через контакт между электродом и мембраной. В настоящей работе значения мембранного потенциала были измерены с использованием менее инвазивной методики — регистрации одиночных ионных каналов в конфигурации "на клетке" (cell-attached). Основываясь на потенциале реверсии токов через NMDA-каналы, определили значение мембранного потенциала в вентропостериомедиальных нейронах 2-7-дневных крысят, который составил около —74 мВ. Эти данные позволили предположить, что в состоянии покоя нейроны таламуса новорожденных крысят не деполяризованы и находятся скорее во вспышечном, нежели в тоническом состоянии активности. Обсуждается значимость этих наблюдений для процессов передачи сенсорных сигналов через таламус и генерации ранних таламокортикальных паттернов активности, в частности, веретенообразных вспышек активности.
Ключевые слова: мембранный потенциал, нейрон, пэтч-кламп, одиночные ионные каналы, ММБЛ, таламус.
Б01: 10.7868/80233475513040087
Электрический потенциал на цитоплазмати-ческой мембране является одним из фундаментальных свойств живой клетки. В нейронах и других возбудимых клетках мембранный потенциал играет ключевую роль в электрогенезе. Большинство ионных каналов клеточных мембран регулируется мембранным потенциалом. Мембранный потенциал может непосредственно влиять на вероятность активации, инактивации и возвращения в активируемое состояние ионных каналов. К таким каналам относится большинство натриевых, кальциевых и калиевых каналов, открывающихся при деполяризации, ИСМ-каналы, активируемые при гиперполяризации и др., а также каналы, управляемые иными факторами (например, нейромедиаторами), но работа которых также регулируется величиной мембранного потенциала. Таким образом, знание величины мембранного потенциала покоя критически важно
для понимания того, как функционирует возбудимая клетка.
Измерение мембранного потенциала представляет непростую экспериментальную задачу. Традиционно для этого используют различные микроэлектродные электрофизиологические методики, такие как, например, внутриклеточная регистрация мембранного потенциала с помощью острых электродов или пэтч-кламп-реги-страция в конфигурации "целая клетка" (whole-cell). Однако эти методики вносят погрешность в измерение мембранного потенциала, поскольку, во-первых, в обоих случаях происходит изменение внутриклеточного ионного состава за счет диализа регистрируемых клеток внутриэлектрод-ным раствором, а во-вторых, в мембране клетки формируется искусственная проводимость (утечка) через место контакта между электродом и клеточной мембраной (около 500 МОм в случае реги-
страции острыми электродами и несколько ГОм при пэтч-кламп-регистрации) [1—5]. Внесение дополнительной ион-неселективной проводимости неизбежно должно приводить к деполяризации клеточной мембраны. Теоретически этот артефакт должен быть максимальным в клетках с высоким электрическим сопротивлением клеточной мембраны [1, 6]. Чтобы избежать этого, были разработаны альтернативные неинвазивные способы измерения мембранного потенциала, основанные на регистрации интегральных токов или одиночных ионных каналов с помощью методики пэтч-кламп в конфигурации "на клетке" (се11-а1-1асИеё). В этом случае сохраняется целостность клеточной мембраны, не происходит ни диализа клетки, ни формирования дополнительной проводимости. Методика основана на том, что мембранный потенциал должен быть равен разности потенциала реверсии токов через ионные каналы известного типа, измеренной в конфигурации "на клетке", и равновесным потенциалом токов через эти каналы. В этом качестве использовали потенциал-активируемые калиевые каналы [7, 8] и ММЭА-каналы [6, 9—13]. Полученные значения мембранного потенциала оказывались существенно больше по абсолютной величине, чем при регистрации от целой клетки или при использовании перфорированного пэтча. Эта разница была особенно выражена у клеток с большим сопротивлением мембраны (лимфоциты [14], незрелые нейроны гиппокампа новорожденных крысят [6]), что вполне согласуется с теоретическими предсказаниями.
Таламус является главным интерфейсом между внешним миром и корой головного мозга млекопитающих животных [15, 16]. Так, нейроны релейного вентропостериомедиального (ВПМ) ядра таламуса получают информацию от мордочки крысы, в частности от вибрисс, и пересылают ее в соматосенсорную кору. Значения мембранного потенциала нейронов релейного таламуса определяют способ их функционирования, т.е. способ передачи информации от сенсорной периферии в кору, — вспышечный либо тонический [17—20]. В состоянии бодрствования нейроны ВПМ деполяризованы (в результате воздействия на них ней-ромедиаторов и гормонов бодрствования, например, норадреналина и ацетилхолина) и находятся в "тоническом" состоянии активности, при котором происходит высокоэффективная, быстрая и стабильная передача потенциалов действия, приходящих от сенсорных органов в кору. В состоянии сна нейроны ВПМ гиперполяризованы в результате снятия деполяризующего тонического воздействия медиаторов бодрствования, и нейроны переходят во "вспышечное" состояние, при котором сенсорные входы запускают вспышку активности, состоящую из множества потенциалов действия. Такие вспышки активности не в со-
стоянии обеспечить эффективную передачу сенсорной информации в кору головного мозга. Зависимые от мембранного потенциала тоническая и вспышечная формы активности нейронов тала-муса обусловлены главным образом инактивацией ИСМ- и низкопороговых кальциевых каналов, а также торможением активности интернейронов ретикулярного ядра (в результате их гиперполяризации под действием ацетилхолина) [20, 21]. Форма активности таламических нейронов также играет важную роль в генерации таламокорти-кальных ритмов, например таких, как веретенообразные осцилляции в фазах 1 и 2 сна [18, 22—25]. Таким образом, уровень мембранного потенциала является важным параметром, который определяет функциональные свойства и форму активности таламических нейронов — тоническую или вспышечную.
В период раннего развития информация от сенсорной периферии (вибрисс), поступающая через нейроны ВПМ таламуса в соматосенсорную кору, играет важную роль в формировании топографических синаптических связей между ВПМ-нейронами и нейронами коры, составляющими основу для так называемых кортикальных карт [26, 27]. У крыс формирование этих карт происходит в течение первой недели после рождения. Этот же период характеризуется уникальными осцилляторными паттернами активности в тала-мокортикальных нейронных сетях, причем тала-мическим нейронам принадлежит роль водителей ритма ранних осцилляций [28—33]. Анализ ответов, вызываемых в сенсорной коре сенсорными стимулами, предполагает вспышечный характер активности таламических нейронов. Вместе с тем регистрация ВПМ-нейронов у новорожденных крысят, проведенная во время первой недели после рождения с помощью метода пэтч-кламп в конфигурации "целая клетка", выявила деполяризацию этих нейронов (значения мембранного потенциала покоя около —50 мВ) и неспособность генерировать низкопороговые спайки (НПС) и вспышечную активность в ответ на стимуляцию внутренней капсулы или на ступеньки искусственной деполяризации [34]. Сходные данные получены и на нейронах зрительного релейного таламуса [35]. Это позволило предположить, что незрелые таламические нейроны деполяризованы и поэтому не в состоянии поддерживать вспышечную форму активности, необходимую для генерации определенных осцилляторных ритмов, в частности, сонных веретен. С другой стороны, ВПМ-нейроны новорожденных крысят характеризуются высоким сопротивлением клеточной мембраны. Поэтому возникает вопрос: является ли деполяризованное состояние незрелых ВПМ-нейронов истинным возрастным феноменом или же значения мембранного потенциала, измеренные путем регистрации в конфигурации "целая клетка", недо-
МЕМБРАННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ НЕЙРОНОВ ТАЛАМУСА
291
оценены вследствие описанного выше феномена утечки. Для ответа на этот вопрос мы измерили мембранный потенциал покоя ВПМ-нейронов у новорожденных крысят с помощью регистрации активности NMDA-каналов в конфигурации "на клетке".
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты проводили на срезах ВПМ ядра таламуса крысят во время первой недели после рождения (постнатальные дни (Р) 2—7). Все экспериментальные протоколы соответствовали этическим нормам по гуманному обращению с животными, принятым в Казанском федеральном университете и в Академии медицинских наук Франции. Перед экспериментом животным проводили анестезию изофлюраном (4%) либо криоанестезию. После выделения головной мозг крысят помещали в охлажденный оксигениро-ванный искусственный цереброспинальный раствор (ИЦСР) следующего состава (в мМ): NaCl 126, KCl 3.5, CaCl2 2.0, MgCl2 1.3, NaHCO3 25, NaH2PO4 1.2 и глюкоза 11 (pH 7.4). Горизонтальные срезы
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.