УДК 576.314
МЕМБРАНОТРОПНЫЕ СВОЙСТВА КОНЪЮГАТОВ БЛОК-СОПОЛИМЕРОВ ЭТИЛЕН- И ПРОПИЛЕНОКСИДА
С ЯНТАРНОЙ КИСЛОТОЙ
© 2013 г. О. В. Бондарь, А. В. Сагитова, Ю. В. Бадеев, Ю. Г. Штырлин, Т. И. Абдуллин*
Казанский (Приволжский) федеральный университет, 420008, Казань, ул. Кремлевская, 18;
*электронная почта: tabdulli@gmail.com Поступила в редакцию 02.07.2012 г.
Получены и охарактеризованы конъюгаты блок-сополимеров этилен- и пропиленоксида (плурони-ков Ь61 и Ь121) с янтарной кислотой. Проведено сравнительное изучение взаимодействия полимеров с мембранами клеток человека (клетки линии ЫеЬа и А549). Адсорбция плуроника Ь121 на клеточной поверхности сопровождается уменьшением, а конъюгатов Ь61 и Ь121 — увеличением отрицательного дзета-потенциала клеток. Инкубация клеток с плурониками в буферном растворе приводит к увеличению проницаемости плазмалеммы для пропидия йодида и ионов; влияние полимеров повышается в ряду: Ь61, конъюгаты Ь121/Ь61, Ы21. Плуроник Ь61 при его культивировании с клетками вызывает уменьшение мембранного потенциала митохондрий, не наблюдаемое для Ь121. Конъюгаты плуроников не так существенно влияют на мембранный потенциал митохондрий, как плуроники, и отличаются меньшей цитотоксичностью, вероятно, вследствие замедления внутриклеточного транспорта модифицированных полимеров. Полученные результаты представляют интерес для разработки безопасных и эффективных систем доставки биологически активных веществ в клетки на основе плуроников.
Ключевые слова: амфифильные полимеры, биоконъюгаты, мембранотропные свойства, цитоток-сичность, трансмембранный потенциал, доставка лекарственных средств.
DOI: 10.7868/S0233475513020035
Амфифильные полимеры широко применяются в химических технологиях, например, в качестве деэмульгаторов, солюбилизаторов, модификаторов поверхностей [1, 2], а также носителей для доставки биологически активных веществ в клетки [3—5]. Особый интерес в биомедицинских приложениях представляют неионогенные блок-сополимеры этиленоксида (ЭО) и пропиленоксида (ПО), в частности, диблок-сополимеры состава (ЭО)х—(ПО)у—(ЭО)х, производимые под торговой маркой плуроники (BASF). Наличие относительно гидрофобного полипропиленоксидного блока и сочлененных с ним относительно гидрофильных полиэтиленоксидных блоков обусловливает амфифильные свойства плуроников.
Плуроники находят применение в качестве мицеллярных форм доставки лекарственных средств [6], иммуноадъювантов [7], компонентов
Сокращения: ЭО — этиленоксид, ПО — пропиленоксид, ГЛБ — гидрофильно-липофильный баланс, ФСБ — фос-фатно-солевой буфер, ККМ — критическая концентрация мицеллообразования.
искусственной крови [8, 9], протекторов клеточных мембран [10, 11]. Согласно современным представлениям плуроники являются перспективными модуляторами биологической активности клеток на молекулярном и мембранном уровнях. Плуроники усиливают накопление цитоток-сических агентов и флуорофоров в клетках млекопитающих и помогают преодолевать множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток при химиотерапии [12, 13].
Биологические свойства плуроников зависят от их молекулярной массы, а также от соотношения мономерных единиц ПО и ЭО, которые, в свою очередь, определяют гидрофильно-липо-фильный баланс (ГЛБ) полимеров. Плуроники с низкими и средними значениями ГЛБ, такие как F68 и P85, посредством полипропиленоксидного блока способны встраиваться в липидный бис-лой, изменяя его текучесть и проницаемость для низкомолекулярных веществ [14, 15]. В экспериментах in vitro плуроники L81, P85, F68 ингибиро-вали ATP-азную активность обратных мембран-
ных транспортеров, таких как MDR-1 (Р-глико-протеин) и MRP-7, что приводило к повышению внутриклеточного накопления их субстратов, включая флуорофоры и антибиотики [12, 16]. Плуроники модулируют клеточный ответ на лекарственную терапию при помощи нескольких механизмов: они облегчают трансмембранный перенос веществ в клетки, усиливают высвобождение вещества из лизосом, ингибируют ATP-аз-ную активность обратных мембранных транспортеров за счет как изменения текучести мембран, так и подавления синтеза ATP в митохондриях и индукции апоптоза [12, 13].
Благодаря этим свойствам плуроники можно применять в виде композиций с противоопухолевыми средствами для увеличения их цитотокси-ческой активности [17]. Однако проблемой остается высокая (цито-)токсичность плуроников с низким ГЛБ вследствие дестабилизации клеточных мембран и негативного влияния на процессы метаболизма.
Перспективной представляется разработка более безопасных и цитосовместимых конъюгатов плуроников с биомолекулами. В настоящей работе плуроники L61 и L121 модифицировали остатками янтарной кислоты, вовлеченной в цикл трикарбо-новых кислот. Несмотря на то, что взаимодействие плуроников с компонентами биологических мембран и их влияние на внутриклеточный метаболизм изучены достаточно хорошо, мембранотроп-ные свойства конъюгатов плуроников с биомолекулами остаются неизвестными. Нами впервые изучено взаимодействие полученных конъюгатов с плазматической и митохондриальной мембранами клеток млекопитающих, а их цитотоксическая активность сопоставлена с активностью исходных плуроников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Реагенты. Диблок-сополимеры ЭО и ПО (аналоги плуроников L61 и L121) произведены фирмой Sigma-Aldrich, янтарный ангидрид, соли и растворители — Acros Organics. Реактивы для работы с культурами животных клеток закуплены в ПанЭко. Йодид пропидия, TMRE, DiOC5(3) приобретены в Sigma-Aldrich. Реактивы для анализа жизнеспособности клеток (МТТ-тест) про-изводены Promega.
Синтез производных плуроников с янтарной кислотой. К 10.0 г (5 ммоль) плуроника L61 (L121), растворенного в 50 мл толуола, добавляли 2.91 г (29.1 ммоль) янтарного ангидрида. Реакцию проводили в течение 2 ч при 90°С и далее 2 ч при 100°С. Растворитель выпаривали на роторном испарителе; остаток растворяли в воде; рН раствора
доводили карбонатом натрия до рН > 9. К полученной соли добавляли разбавленную серную кислоту до рН < 2, продукт экстрагировали бута-нолом (2 х 180 мл). Экстракт последовательно высушивали над безводным сульфатом натрия и на роторном испарителе и далее реэкстрагировали хлороформом (3 х 100 мл). Растворитель удаляли в вакууме для получения продукта — желтого маслообразного вещества. Выход конъюгатов плуроников L61 и L121 с янтарной кислотой составил 9.0 г (86%) и 9.8 г (94%) соответственно.
Характеристика конъюгатов плуроников с янтарной кислотой. Количество остатков янтарной кислоты в модифицированных полимерах определяли методом кислотно-основного титрования, по данным которого конъюгаты плуроника L61 и L121 содержат, соответственно, один и два кислотных остатка (янтарной кислоты) на молекулу полимера. Структура модифицированных плуроников охарактеризована методами ЯМР-спектроскопии с использованием спектрометра Varian Unity-300 и ИК-фурье-спектроскопии с использованием спектрометра Vector 22 (Bruker). 13C ЯМР (75 МГц, CDCl3), 5: 17.25 (СН3), 70.34 (СН2), 73.14 (СН2), 75.14 (СН), 172.25 (С(О)ОН). ИК-спектры модифицированных плуроников содержат характерную для карбоксильной группы полосу колебаний при v = 1750 см-1, не наблюдаемую у исходных полимеров.
Критическую концентрацию мицеллообразо-вания (ККМ) плуроников и их конъюгатов определяли с использованием пиренового индикатора [18, 19]. В лунки 96-луночного планшета (Nunc) вносили по 20 мкл раствора пирена в метаноле в концентрации 1.25 х 10-5 М. После испарения растворителя в лунки с осадком пирена вносили 200 мкл раствора плуроников в различной концентрации в фосфатно-солевом буфере (ФСБ). Планшет инкубировали при 37°С в течение 30 мин для растворения пирена и его перераспределения в гидрофобную фазу полимерных мицелл. Спектры флуоресценции пирена регистрировали на флуоресцентном планшетном ридере Infinite 200 PRO (Tecan) в диапазоне X = 365-410 нм при Хвозбуждения = = 339 нм. Величину ККМ плуроников вычисляли по графику зависимости интенсивности флуоресценции пирена при Xmax = 373 нм от логарифма концентрации полимера как описано в [18, 19].
Гидродинамический диаметр агрегатов исходных и модифицированных плуроников исследовали методом динамического светорассеивания на анализаторе Zetasizer Nano-ZS (Malvern) в ФСБ при 25°С и в культуральной среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, при 37°С. Регистрируемые данные интенсивности светорассеяния обра-
батывали при помощи программы Malvern DTS (в соответствии с теорией Ми) и представляли в шкале, пропорциональной численному распределению диаметров частиц, выраженному в процентах.
Анализ цитотоксичности плуроников. Клетки аденокарциномы человека линии HeLa и А549 культивировали в полистироловых флаконах в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупногорогатого скота, 2 мМ L-глу-тамина, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 ед./мл пенициллина в СО2-инкубаторе при 37°С и 5% СО2. Клетки выращивали до достижения монослоя и диссоциировали с использованием раствора трипсин—EDТА. Плотность клеток в суспензии оценивали на гемоцитометре.
Цитотоксичность плуроников определяли при помощи пролиферативного MTT-теста. Клетки рассевали в 96-луночный планшет (по 1000 клеток в лунку) и прекультивировали в течение 12 ч в стандартных условиях. В культуральную среду вносили аликвоту растворов плуроников в ФСБ в разной концентрации и культивировали клетки в течение 3 сут. После инкубации в лунки вносили по 20 мкл реагента MTT (5 мг/мл в DMEM), смесь выдерживали 2 ч, затем культуральную среду заменяли на DMSO и измеряли поглощение в лунках при 550 нм на планшетном анализаторе Infinite 200 PRO (Tecan). Жизнеспособность клеток считали пропорциональной поглощению раствора и выражали в процентах относительно контроля (ФСБ), принимаемого за 100%. Цитотоксич-ность оценивали по величине концентрации полимера, при которой рост клеток подавлялся на 50% (ингибирующая концентрация, /С50).
Исследование дзета-потенциала и трансмембранного потенциала клеток. Влияние плуроников на дзета-потенциал клеток оценивали методом динамического светорассеяния в режиме электрокинети
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.