научная статья по теме МЕРИСТЕМАТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ОПУХОЛЕЙ, ИНДУЦИРОВАННЫХ AGROBACTERIUM TUMEFACIENS, У ГОРОХА Биология

Текст научной статьи на тему «МЕРИСТЕМАТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ОПУХОЛЕЙ, ИНДУЦИРОВАННЫХ AGROBACTERIUM TUMEFACIENS, У ГОРОХА»

ГЕНЕТИКА, 2015, том 51, № 1, с. 54-62

ГЕНЕТИКА РАСТЕНИЙ ^

УДК 575.16:581.14:581.2

МЕРИСТЕМАТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ОПУХОЛЕЙ, ИНДУЦИРОВАННЫХ Agrobacterium tumefaciens, У ГОРОХА © 2015 г. А. П. Виноградова, М. А. Лебедева (Осипова), Л. А. Лутова

Санкт-Петербургский государственный университет, кафедра генетики и биотехнологии, Санкт-Петербург 199034 e-mail: mary_osipova@mail.ru Поступила в редакцию 16.04.2014 г.

Известно, что в развитии опухолей у растений важную роль играют две ключевые группы гормонов растений — ауксины и цитокинины. Формирование опухолей, индуцированных агробактериями, обусловлено горизонтальным переносом в геном растения онкогенов бактерий, вовлеченных в биосинтез этих гормонов. Роль транскрипционных факторов в развитии опухолей изучена в меньшей степени. Можно предположить, что развитие опухолей, связанное с патологической пролиферацией клеток, может регулироваться с участием того же набора транскрипционных факторов, которые контролируют пролиферацию клеток в норме, и, в частности, транскрипционных факторов, регулирующих активность меристем. В настоящей работе проанализированы гистологическая организация и распределение пролиферирующих клеток в опухолях, индуцированных Agrobacterium tumefaciens на гипокотиле гороха. Кроме того, проведен анализ экспрессии некоторых меристем-специ-фичных генов при развитии таких опухолей. В целом результаты нашей работы указывают на то, что в индуцированных A. tumefaciens опухолях присутствуют меристематические структуры и что развитие опухолей сопряжено с изменением уровня экспрессии одного из ключевых регуляторов активности апикальной меристемы корня — гена WOX5.

DOI: 10.7868/S0016675815010129

Рост и развитие растения определяется соотношением двух основных процессов — пролиферации и дифференцировки клеток. Нарушения регуляции этих процессов приводят к различным аномалиям развития. При неконтролируемой пролиферации клеток может происходить образование опухолей. Контроль пролиферации и дифференцировки клеток осуществляется посредством фитогормонов, а также транскрипционных факторов (ТФ) — регуляторов экспрессии генов. Опухоли растений имеют различную природу и могут возникать как в результате воздействия фитопатогенов, так и в результате нарушений в работе систем, контролирующих пролиферацию клеток растений. В развитии опухолей у растений важную роль играют две ключевые группы гормонов растений — ауксины и цитокинины. Так, известно, что развитие опухолей, индуцированных агробактериями, связано с горизонтальным переносом в геном растения онкогенов бактерий, вовлеченных в биосинтез этих гормонов растений [1]. Роль ТФ в развитии опухолей изучена в меньшей степени. Можно предположить, что развитие опухолей, связанное с патологической пролиферацией клеток, может регулироваться с участием того же набора ТФ, которые контролируют пролиферацию клеток в норме, и может сопровождаться возобновлением экспрессии генов, в норме регулирующих актив-

ность меристем. Настоящая работа направлена на изучение роли меристем-специфичных генов в развитии опухолей, индуцированных A. tumefaciens на гипокотиле у гороха.

Известно, что большинство патогенов, вызывающих неопластические разрастания тканей растений, воздействуют на пролиферацию растительных клеток за счет изменения в тканях растений баланса фитогормонов — ауксинов и цитоки-нинов [2]. Наиболее изученной группой патогенных организмов, индуцирующих образование опухолей у растений, являются почвенные бактерии рода Agrobacterium. Род Agrobacterium — уникальная группа фитопатогенных бактерий, способных переносить фрагмент вирулентной плазмиды, включающий гены метаболизма фитогормонов, в геном растения-хозяина [1]. Экспрессия этих генов вызывает нарушение деления и дифференци-ровки растительных клеток, что приводит к развитию гиперплазий. A. tumefaciens вызывает опухоли в месте сочленения корня и стебля растения — корневой шейке, или короне (англ. down), вследствие чего болезнь называется "корончатый галл" (crown gall). Корончатый галл представляет собой типичную опухоль, которая характеризуется быстрой пролиферацией клеток, способностью к гормоннезависимому росту и полной потерей способности к регенерации [3].

Причиной аномальной пролиферации растительных клеток является экспрессия онкогенов, переносимых в составе Т-ДНК из Ti (Tumor in-ёис1^)-плазмиды Agrobacterium tumefaciens. Среди них — гены, ответственные за биосинтез ауксинов (aux1/iaaM/tms1 и aux2/iaaH/tms2) и цитоки-нинов (cyt/ipt/tmr) [4, 5]. Например, в корончатом галле на клещевине уже ко второй неделе после индукции опухоли уровни свободной ИУК и зеа-тин-рибозида были повышены в 15 раз [6]. С помощью ауксин-регулируемых репортерных конструкций DR5::GUS и GH3::GUS в опухолях, индуцированных A. tumefaciens у арабидопсиса и клевера соответственно, наблюдали активный ответ на ауксин, что согласутеся с данными по высокому содержанию свободного ауксина в опухолях [7]. Помимо влияния на биосинтез ауксинов и цитокининов, экспрессия генов Т-ДНК A. tumefaciens в тканях вызывает также изменение концентрации фитогормонов других групп: этилена, абсцизовой кислоты, жасмоновой кислоты. Кроме того, в составе Т-ДНК A. tumefaciens содержится ген 6b, обладающий онкогенной активностью: его экспрессия у трансгенных растений стимулирует опухолеобразование, гормоннезависимое деление клеток каллуса и изменение морфологии листа [8]. Белок 6b имеет гистон-шапероновую активность и участвует в эпигенетической регуляции экспрессии генов KNOX класса I [9].

Изучение анатомии опухолей, индуцированных A. tumefaciens на различных растениях, показало, что в большинстве случаев опухоли развиваются из клеток камбия [10]. При этом в тканях опухоли происходит активное развитие проводящей системы: наблюдается дифференцировка трахеид и возникновение ситовидных элементов [11].

Данные литературы указывают на ключевую роль гормонов, прежде всего цитокининов и ауксинов, в развитии опухолей, индуцированных A. tumefaciens. Каким образом изменяется экспрессия генов растения в ответ на изменение гормонального баланса в опухолевых тканях, известно в меньшей степени. В связи с этим особый интерес представляет изучение роли генов, регулирующих активность меристем растений, в развитии опухолей. Известно, что ключевые гены, контролирующие активность меристем, кодируют гомеодо-мен-содержащие ТФ, относящиеся к семейству KNOX и WOX [12—14]. Среди них в апикальной меристеме побега (ПАМ) у арабидопсиса наиболее изучена функция гена WUS (WUSCHEL) из семейства WOX и генов STM (SHOOTMERISTEMLESS), KNAT1 {KNITTED-LIKE FROM ARABIDOPSIS THALIANA 1) из семейства KNOX. Известно, что экспрессия этих генов активируется при воздействии цитокининов [15—19]. Вместе с этим известно, что действие ТФ WUS, STM, KNAT1 в ПАМ направлено на усиление метаболизма и передачи сигнала цитокининов. Так, ТФ WUS уси-

ливает ответ на цитокинин в ПАМ, блокируя экспрессию генов ARR A-типа, кодирующих репрессо-ры цитокининового ответа [20], а ТФ семейства KNOX, STM и KNAT1 активируют экспрессию генов биосинтеза цитокининов IPT [21, 22]. Другой предствитель семейства генов WOX — WOX5 — кодирует гомеодомен-содержащий ТФ, функционирующий в покоящемся (организующем) центре апикальной меристемы корня (КАМ) и необходимый для поддержания меристематической активности ее клеток [12, 23, 24]. Было показано, что экспрессия гена WOX5 активируется под действием ауксина [25, 26], с другой стороны, ТФ WOX5 активирует биосинтез ауксина через активацию гена YUC1 [27]. Помимо WOX5 в регуляции активности КАМ участвуют также другие ТФ: SCARECROW (SCR) и SHORTROOT (SHR), относящиеся к семейству GRAS, а также ТФ PLETHORA (PLT), относящиеся к группе ТФ с AP2-доменом, необходимые для функционирования КАМ [28—30]. Показано, что действие ТФ PLT также связано с ауксином: ауксин регулирует экспрессию генов PLT, а продукты генов PLT, в свою очередь, необходимы для поддержания градиента ауксина в кончике корня за счет регуляции экспрессии генов PIN, кодирующих белки — переносчики ауксина [31].

Таким образом, меристем-специфичные ТФ, контролирующие работу апикальных меристем, действуют в тесной взаимосвязи с гормонами растений. Можно предположить, что при развитии опухолей растений на фоне измененного гормонального баланса также может происходить изменение уровня экспрессии меристем-специ-фичных генов. Изучение экспрессии меристем-специфичных генов при развитии опухолей, индуцированных A. tumefaciens, позволит лучше понять механизмы, регулирующие пролиферацию растительных клеток в различных системах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал и условия выращивания растений. В работе использовали горох (Pisum sativum L.) сорта Frisson из коллекции ГНУ "Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии" (http:// www.arriam.spb.ru/eng/lab9/collections.html).

Семена гороха стерилизовали с использованием концентрированной серной кислоты в течение 10 мин с последующей 5-кратной промывкой в стерильной воде, затем семена высевали на 1%-ный водный агар и проращивали в темноте в течение 4—5 сут. Опухоли индуцировали штаммом A. tumefaciens С58. Для этого с помощью иглы наносили укол в область гипокотиля проростков гороха. Далее в область поранения наносили ~1 мкл суспензии, полученной из клеток бактерий A. tumefaciens, выращенных на твердой среде LB, ресус-

Таблица 1. Последовательности праймеров, используемых для идентификации фрагментов генов гороха ЖОХ4, ШОХЗ, БИЯ и РЬТ

Последовательности в базе данных GenBank Medicago truncatula и других видов, используемые для подбора праймеров Последовательности праймеров для идентификации генов гороха

M. truncatula (GenBank: AC148486), Arabidopsis thaliana (GenBank: FJ440850.1) PsWOX4_FOR: ATGGAATCCRACWCAAGAACA PsWOX4_REV: GGRTGTRATGGRAAAAGCTC

M. truncatula (GenBank: EF128058), Lotus corniculatus var. japonicus (GenBank: AY790248.1) PsKNOX3_FOR1: CAAAGCYTAACAGGAGTTTCACC PsKNOX3_REV1: TTCCTCTTCCTTTGATTGATAAACC

M. truncatula (GenBank: XM 003611530.1), Cicer arietinum (GenBank: XM_004511778.1) PsSHR_FOR: TACA

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком