ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2007, № 3, с. 376-380
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 616.15532 :616-006
МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ЛИМФОЦИТОВ И ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК У МЫШЕЙ С АСЦИТНОЙ КАРЦИНОМОЙ ЭРЛИХА В ПРОЦЕССЕ РОСТА ОПУХОЛИ
© 2007 г. Е. В. Инжеваткин*, Е. Ю. Фоменко**, Е. В. Слепов**, А. А. Савченко**
*Международный научный центр исследований экстремальных состояний организма при Президиуме Красноярского научного центра СО РАИ, 660036 Красноярск, Академгородок, 50 **Сибирский федеральный университет, 660041 Красноярск, просп. Свободный, 79
E-mail: inscience@mail.ru Поступила в редакцию 16.06.2006 г.
Исследованы изменения активности НАД- и НАДФ-зависимых ферментов лимфоцитов и опухолевых клеток у мышей с асцитной карциномой Эрлиха и изменения концентраций оксалоацетата, лак-тата и НАД + в процессе роста опухоли. Обнаружено, что на протяжении большего периода роста опухоли в лимфоцитах создаются условия для повышения интенсивности аэробных реакций, направленных на воспроизводство энергии, при некотором снижении интенсивности синтетических процессов. В опухолевых клетках преимущественно возникают условия для интенсификации реакций пластического обмена и реакций, связанных с анаэробным воспроизводством энергии.
Иммунная система играет важнейшую роль в противоопухолевой защите организма, распознавая и уничтожая опухолевые клетки (Dobrzanski et al., 2000; Hishii et al., 1999; Gordon, 1999). Однако и опухоль, помимо прямого действия на прилегающие ткани, выделяет во внутреннюю среду организма многочисленные токсины и регуля-торные факторы, что способствует нарушению работы различных органов и систем организма, в том числе иммунной системы (O'Sullivan et al., 1996; Bennet et al., 1998; Cheng, Lopez, 1998; Huang et al., 1998). Таким образом, исход опухолевого процесса во многом будет определяться способностью клеток иммунной системы противостоять негативному воздействию опухоли с одной стороны, и чувствительностью опухолевых клеток к воздействию защитных факторов организма - с другой.
В этой связи большой интерес представляет вопрос о том, каким образом взаимодействие опухолевых и иммунных клеток влияет на характер протекающих в них метаболических процессов. Ведь именно от работы метаболических путей напрямую зависят и функции клеток иммунной системы, и способность опухолевых клеток к делению (Булыгин и др., 1999; Tian et al., 1998; Rais 1999). Изучение параллельно протекающих в опухолевых и иммунных клетках метаболических процессов позволит создать основу для дальнейших исследований по оптимизации курсов химиотерапии злокачественных новообразований, поскольку появится возможность выбирать периоды для наиболее эффективного использования
противоопухолевых препаратов, применяя их тогда, когда они будут оказывать наибольший повреждающий эффект именно на клетки опухоли и, в меньшей степени, на клетки иммунной системы.
Цель настоящей работы - изучение метаболических изменений лимфоцитов и опухолевых клеток у мышей в процессе роста асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовались лабораторные мыши ICR обоих полов (в равном соотношении) в возрасте около 2.5 мес., с массой тела 20-23 г, полученные в питомнике Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" (Новосибирская обл.). Клетки АКЭ вводили в брюшную полость животных в количестве 3 х 106 клеток на одно животное в 0.2 мл физиологического раствора. Перед введением клетки трижды отмывались в физиологическом растворе от асцитной жидкости животного-донора центрифугированием в течение 5 мин в центрифужном поле 400 g.
Взятие крови и клеток АКЭ осуществляли на 5, 7, 9, 11, 13 и 15-е сут после прививки опухоли, считая день прививки первыми сутками роста опухоли. Кровь брали также у интактных мышей. Животные с опухолью умирали начиная с 13-х сут, к 15-м сут смертность мышей составляла 20%. Взятие крови осуществляли у животных, предварительно усыпленных эфиром, из подклю-
чичной артерии. Сразу выделяли из крови лимфоциты в градиенте фиколл-урографина (плотность 1.083 г/мл) и трижды отмывали от плазмы крови в охлажденном физиологическом растворе центрифугированием в условиях, аналогичных условиям отмывания опухолевых клеток от ас-цитной жидкости, описанным выше.
После взятия крови животных умерщвляли дислокацией шейных позвонков, проводили лапа-ротомию и из брюшной полости извлекали асцит-ную опухоль. Опухолевые клетки отмывали от асцитной жидкости также как это было описано выше. Гомогенизирование лимфоцитов и опухолевых клеток осуществляли по методу, описанному в работе Кочетова (1980).
Биолюминесцентным методом определяли активность НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы (НАДИЦДГ), НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы (НАДФИЦДГ), малатдегидрогеназы (МДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), НАД- и НАДФ-за-висимых глутаматдегидрогеназ (НАДГДГ и НАДФГДГ), глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (Г3ФДГ), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), глутатионредуктазы (ГР) (Савченко, Сунцова, 1989; Савченко, 1991). Активность ферментов выражали в единицах ферментативной активности на 1 мг белка. Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорда (Досон и др., 1991). Также с помощью биолюминесцентных методов в клетках определяли концентрации оксалоацета-та, лактата и НАД+.
В работе использовали 20-24 животных на каждую точку. Для всех полученных данных определяли среднее арифметическое значение и ошибку средней арифметической. Проверку гипотезы о статистической достоверности различия выборок проводили с помощью критерия Манна-Уитни (Лакин, 1990).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Как следует из данных, представленных на рис. 1а, активность НАДИЦДГ в лимфоцитах и опухолевых клетках достоверно не различается с 7-х по 13-е сут роста опухоли. На 5-е и 15-е сут активность НАДИЦДГ в лимфоцитах выше, чем в опухолевых клетках. Реакция, катализируемая данным ферментом, наряду с цитратсинтазной реакцией, является одной из наиболее медленных в цикле трикарбоновых кислот (ЦТК) и может лимитировать общую скорость потока метаболитов по циклу. Следовательно, установленные различия в уровнях активности НАДИЦДГ свидетельствуют о том, что в начальный и конечный периоды развития опухоли лимфоциты оказываются в более выгодных условиях с точки зрения интенсивности работы ЦТК.
Активность другого фермента ЦТК-МДГ, также на большей части исследованного временного интервала не различается для опухолевых клеток и лимфоцитов (рис. 16). Однако на 13-е сут активность фермента была намного выше в лимфоцитах. Кроме того, продукт реакции МДГ -оксалоацетат - в лимфоцитах не был нами обнаружен на протяжении всего исследованного периода даже таким чувствительным методом, как биолюминесцентный. Следовательно, последующие реакции ЦТК в лимфоцитах идут достаточно эффективно, и этот продукт в клетке не накапливается. Вместе с тем, в клетках АКЭ оксалоацетат был нами обнаружен на 11-е и 13-е сут роста опухоли в концентрациях 3.02 ± 1.38 и 0.39 ± ± 0.22 нмоль/мг белка соответственно.
Вспомогательным ферментом цикла Кребса является НАДФИЦДГ, и в норме его активность невелика. В нашем исследовании было зафиксировано только 2 периода, когда активность данного фермента определялась в лимфоцитах - это 5-е и 13-е сут роста опухоли (рис. 1в). Обращает на себя внимание то обстоятельство, что 5-е и 13-е сут это окончание лаг-фазы роста опухоли и начало терминального периода болезни соответственно (Эммануэль, 1977). По-видимому, эти дни являются в достаточной степени критическими для метаболизма клеток иммунной системы. Вместе с тем, в клетках АКЭ активность фермента определялась в течение всего исследованного периода, снижаясь к 15-м сут роста опухоли.
Активность ЛДГ лимфоцитов в течение всего исследованного периода примерно вдвое превышает активность этого фермента в опухолевых клетках (рис. 1г). В полном соответствии с этим содержание лактата в лимфоцитах в течение всего исследованного периода, за исключением 15-х сут, намного меньше, чем в клетках АКЭ (рис. 2а). Таким образом, можно сделать вывод о преобладании в лимфоцитах аэробных обменных процессов, тогда как в опухолевых клетках, по-видимому, преобладают анаэробные энергетические процессы. Наблюдающийся при этом практически постоянный значительный рост содержания окисленного НАД+ в клетках АКЭ (рис. 26), скорее всего, также свидетельствует об изменении соотношения между анаэробным и аэробным путями получения энергии в пользу анаэробного при том, что в лимфоцитах уровень НАД+, как и уровень лактата, остается все время на сравнительно стабильном уровне.
Для понимания происходящих в клетках метаболических изменений важное значение имеет изучение активности ферментов, осуществляющих перемещение субстратов между энергетическим и пластическим направлениями обмена.
25000 20000 15000 10000 5000 0
300 ¡3 250
I200
2 150 £ Ё 1001 9 50 0 12 10 8 6 4 2 0
(г)
40 30 20^ 10Т-
0 20
15
10
5£
0 35 30 25 20 15'
104 5? 0
(б)
_1_I_I_I_I
(д)
30 25 20 15
ю£
5 т 0 20
J_I_I_I_I
(з)
_|_I_I_I_I
7 9 11 13 15
(в)
А 1 ■ 2
Рис. 1. Активность НАД- и НАДФ-зависимых ферментов в лимфоцитах (1) и опухолевых клетках мышей с асцитной карциномой Эрлиха (2) в процессе роста опухоли: а - НАДИЦДГ, б - МДГ, в - НАДФИЦДГ, г - ЛДГ, д - НАДГДГ, е - НАДФГДГ, ж - Г3ФДГ, з - Г6ФДГ, и - ГР. По оси абсцисс - продолжительность роста опухоли, сут (для рис. 1, 2). По оси ординат - активность фермента, мкЕ/мг белка.
Нмоль/мг белка (а)
9000 г 30 _
8000 -
7000 - 25 -
6000 - 20 -
5000 4000 _ 15 -
3000 - у / \ 10 -
2000 1000! - / 5
: л-
0 -#— 1 1 0! г
(б)
А 1 ■ 2
11
13
15
Рис. 2. Концентрация лактата (а) и НАД+ (б) в лимфоцитах (1) и опухолевых клетках мышей с асцитной карциномой Эрлиха (2) в процессе роста опухоли. По оси ординат - концентрация, нмоль/мг белка.
К таким ферментам, в частности, можно отнести НАДГДГ и НАДФГДГ, Г3ФДГ и Г6ФДГ.
Из полученных нами данных следует, что активность НАДГДГ и НАДФГДГ в лимфоцитах на протяжении большей части исследованного периода превышает таковую в опухолевых клетках (рис. 1д, е). Следовательно, в
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.