МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 4, с. 418-424
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.66
МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ МУТАНТОВ ДРОЖЖЕЙ РЛСИУБОЬЕМ тштгшьт, ПРОДУЦИРУЮЩИХ КСИЛИТ И ЭТАНОЛ ИЗ D-КСИЛОЗЫ
© 2015 г. О. И. Болотникова*, 1, О. В. Мещерякова**, Н. П. Михайлова***, А. И. Гинак***
*Петрозаводский государственный университет **Институт биологии КарНЦРоссийской Академии Наук, Петрозаводск ***Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет)
Поступила в редакцию 17.09.2014 г.
Изучена активность основных ферментов катаболизма Б-ксилозы у мутантов ксилозоассимилиру-ющихдрожжей Раску8о1вп tаппорЫ1т, селективно продуцирующих ксилит, либо этанол. Штамм, образующий ксилит, характеризовался низкими активностями ксилозоредуктазы с преимущественным сродством к НАДФН, ксилитдегидрогеназы, НАД+-зависимой малатдегидрогеназы и цито-хром-с-оксидазы (4.40, 4.80, 1.87 и 0.28 мкмоль/мг мин соответственно). В клетках мутантов, продуцирующих этанол, увеличены активности НАДН/НАДФН-ксилозоредуктазы и ксилитдегидрогеназы до 6.80 и 8.60 мкмоль/мг мин, а также 1-глицерофосфатдегидрогеназы и лактатдегидроге-назы до 4.68 и 16.48 мкмоль/мг мин. Обсуждается влияние дисбаланса НАДФН/НАДН на спирто-образование и накопление ксилита.
Ключевые слова: Б-ксилоза, ксилит, этанол, дрожжи Ра. 1аппоркйт.
DOI: 10.7868/S0026365615040059
Известно, что ксилозоассимилирующие дрожжи обычно продуцируют либо ксилит, либо этанол из D-ксилозы. Только природные штаммы Pachysolen tannophilus могут образовывать одновременно их сопоставимые количества [1]. Предполагают, что накопление ксилита индуцирует дисбаланс коферментов НАДФН/НАДН [2, 3], обеспечивающих начальные реакции превращения D-ксилозы в D-ксилулозу [4, 5]. Дальнейший распад D-ксилулозы осуществляют ферментные системы пентозофосфатного цикла (Варбурга-Дикенса—Хорекера), гликолиза (Эмбдена-Мейер-гофа-Парнаса), а также цикла Кребса. Следовательно, этапы, лимитирующие и стимулирующие образование этанола, затрагивают различные стадии общих путей углеводного обмена, локализованных как в цитозоле, так и митохондриях.
До сих пор не установлено, какие именно особенности катаболизма D-ксилозы являются причинами селективной продукции ксилита или этанола дрожжевой клеткой. Удобным объектом для такого рода исследований, на наш взгляд, являются мутанты Pa. tannophilus, которые, в отличие от штаммов дикого типа, избирательно накапливают данные продукты [6]. Вероятно, их уникаль-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: bolot@onero.ru).
ные способности отражают изменения не только начальных стадий распада Б-ксилозы, но также общих путей катаболизма сахаров.
Поэтому цель настоящей работы заключалась в определении активности ксилозоредуктазы (ЕС 1.1.1.21) и ксилитдегидрогеназы (ЕС 1.1.1.9), катализирующих реакции образования Б-ксилулозы, а также цитозольных 1-глицерофофатдегидрогеназы (ЕС 1.1.1.8), лактатдегидрогеназы (ЕС 1.1.1.27), ми-тохондриальной цитохром-с-оксидазы (ЕС 1.9.3.1) и общей НАД+-зависимой малатдегидрогеназы (ЕС 1.1.1.37) у мутантов Ра. tannophilus, продуцирующих либо ксилит, либо этанол.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования. В работе использовали мутанты Ра. tannophilus 22-У-1532 № 390, № 442 и № 664 с измененным ростом на Б-ксилозе, ксилите или этиловом спирте в качестве единственного источника углерода (фенотипы Glu+Xyl+XylOH±EtOH-, Glu+Xyl+XylOH-EtOH+ и Glu+Xyl±XylOH±EtOH± соответственно), которые продуцировали этанол или ксилит из Б-ксилозы [6]. Исходный родительский штамм Ра. tannophilus 22-У-1532, накап-
Таблица 1. Особенности ассимиляции Б-ксилозы мутантами дрожжей Ра. tаппорЫ1т
Мутант Ксилит, г/г* Этанол, г/г* Потребление D-ксилозы Биомасса, г/г*
скорость, г/л ч степень, %
664 0.25 ± 0.01 0.05 ± 0.01 0.51 ± 0.09 56.0 ± 1.0 0.05 ± 0.01
390 <0.01 0.24 ± 0.01 0.73 ± 0.07 86.0 ± 1.0 0.09 ± 0.01
442 0.26 ± 0.01 78.6 ± 1.0
К 0.11 ± 0.01 0.21 ± 0.01 0.62 ± 0.09 68.8 ± 1.0 0.12 ± 0.01
Примечание. К — исходный гаплоидный штамм Ра. 1аппоркИш 22-У-1532.
* Экономический выход продуктов микроаэробной ферментации рассчитывали на грамм потребленной Б-ксилозы. Жирным шрифтом выделены наибольшие продуктивности ксилита, этанола и активности соответствующих ферментов.
ливавший оба продукта в сопоставимых количествах, служил контролем.
Инокулюм для ферментаций получали, выращивая дрожжи в колбах на 500 мл, содержащих 100 мл жидкой среды YEPD с 2% D-глюкозой в качестве единственного источника углерода [7] при интенсивности перемешивания 230 об/мин и температуре 30 ± 2°С. Через 18—24 ч роста 10 мл дрожжевой суспензии из этих колб переносили в 500 мл колбы, содержащие 100 мл жидкой среды YEPD с 2% D-ксилозы в качестве единственного источника углерода [7], которые инкубировали в тех же условиях. Полученную таким образом биомассу использовали для микроаэробной ферментации в количестве 6.0 г/л а.с.в.
Микроаэробные ферментации проводили в 250 мл колбах, содержащих 100 мл жидкой среды YEPD с 2% D-ксилозы при интенсивности перемешивания 100 об/мин, температуре 30 ± 2°С в течение 24 ч. Концентрацию биомассы после окончания ферментации анализировали спектро-фотометрически на приборе СФ-26 (Польша) при условиях, подробно изложенных в [6]. Количество редуцирующих веществ определяли по Феллингу. Этиловый спирт и ксилит анализировали методом газовой хроматографии (Vista 600, "Varian", США) при условиях, отраженных в [1].
Бесклеточные экстракты дрожжей получали согласно рекомендациям, подробно изложенным в [6]. Для разрушения митохондриальных мембран гомогенизацию осуществляли растиранием клеток с порошком кварцевого стекла в 0.01 М трис-HCl буферном растворе (рН 7.5), содержащем 0.1% тритона Х-100, осаждая полученную смесь при 20000 об./мин, температуре 0°С в течение 30 мин [8]. Концентрацию белка в бесклеточных экстрактах определяли методом Лоури [9], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.
Общую и специфическую ферментативные активности ксилозоредуктазы и ксилитдегидрогена-зы оценивали по изменению концентрации НАД(Ф)Н/НАД(Ф)+, измеряя оптическую плот-
ность реакционной смеси на спектрофотометре СФ-26 при 340 нм, температуре 20°С в пробах с одинаковой концентрацией белка. Для поправки на эндогенную активность вводили внутренний контроль, содержащий все компоненты реакционной смеси за исключением субстрата (D-ксилоза или ксилит). За единицу активности каждого фермента принимали его количество, способное восстановить (окислить) 1 мкМоль НАД(Ф)Н/НАД(Ф)+ за 1 мин [8].
Общую активность ферментов лактатдегидро-геназы, НАД+-зависимой малатдегидрогеназы и 1-глицерофосфатдегидрогеназы в бесклеточных экстрактах определяли спектрофотометрически по изменению концентрации НАДН [10]. Активность цитохром-с-оксидазы оценивали по методике Смита [11], предварительно восстанавливая цитохром с двухкратным по массе количеством аскорбиновой кислоты в 0.02 М фосфатном буферном растворе (рН 7.0) в течение 2 ч и выделяя ее свободную от избытка аскорбата форму на колонке с сефадексом G-25.
Статистическую обработку экспериментальных результатов проводили, используя критерий Стью-дента [12] при уровне значимости, равном 0.05 с помощью компьютерной программы MS Excel.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Характеристика микроаэробной конверсии D-ксилозы. Особенности микроаэробной ферментации Б-ксилозы мутантами Ра. tannophilus 22-У-1532, накапливающими либо ксилит, либо этиловый спирт иллюстрирует табл. 1. Можно заключить, что увеличению продукции ксилита почти в 2.3 раза сопутствовало уменьшение скорости роста культуры, степени потребления Б-ксилозы, а также незначительный прирост биомассы дрожжей. Это косвенно подтверждает ингибирование у штамма № 664 с ослабленным ростом на ксилозе, ксилите и этиловом спирте в качестве единственного источника углерода (фенотип
Таблица 2. Активность начальных этапов катаболизма Б-ксилозы у мутантов Ра. 1аппорЫ1т
Основной продукт Мутант Активность, мкмоль/мг мин
Ксилозоредуктаза Ксилитдегидрогеназа
НАДФН НАДН Общая НАД+ НАДФ+ Общая
Ксилит 664 3.00 ± 0.08 1.40 ± 0.08 4.40 ± 0.08 4.55 ± 0.10 0.25 ± 0.10 4.80 ± 0.10
Этанол 390 2.80 ± 0.10 3.20 ± 0.10 6.00 ± 0.10 8.00 ± 0.10 0.40 ± 0.10 8.40 ± 0.10
442 3.60 ± 0.10 3.20 ± 0.10 6.80 ± 0.10 6.45 ± 0.09 0.35 ± 0.09 6.80 ± 0.09
К 5.00 ± 0.09 5.40 ± 0.09 10.40 ± 0.09 7.70 ± 0.09 0.30 ± 0.09 8.00 ± 0.09
Glu+Xyl±XylOH±ЕЮН±) реакций, включающих Б-ксилозу в общие пути катаболизма Сахаров.
Лучшую на 19 и 27% продукцию этанола по сравнению с контролем наблюдали при увеличении скорости и степени потребления Б-ксилозы (табл. 1). Принимая во внимание меньший, чем у контрольного штамма Ра. tannophilus 22-У-1532 прирост биомассы (0.09 и 0.12 г/г потребленной Б-ксилозы соответственно), предположили, что в клетках штамма № 390 фенотипа Glu+Xyl+Xy-ЮН±ЕЮН" (ослабленный рост на ксилите, неспособность ассимилировать этанол в качестве единственного источника углерода) и штамма №442 фенотипа Glu+Xyl+XylOH-EtOH+ (отсутствие роста на ксилите в качестве единственного источника углерода) генетические изменения затрагивают какие-либо этапы общих путей катаболизма сахаров.
Активность ключевых ферментов катаболизма D-ксилозы. Изучение большой выборки природных штаммов дрожжей ранее подтвердило, что ксилозоредуктаза и ксилитдегидрогеназа не только имеют принципиальное значение для катаболизма Б-ксилозы [2, 3, 13], но также оказывают сильное влияние на продукцию ксилита и этанола [4, 5]. Их анализ у мутантов Ра. tannophilus 22-У-1532 выявил следующие закономерности (табл. 2).
В клетках штамма № 664 ^^у^уЮ^ЕЮ^) активность ферментов, регулирующих образование Б-ксилулозы, минимальна. Примечательно, что доля НАДФН-зависимой ксилозоредуктазы упомянутого мутанта составляла 67% общей активности, хотя 95% активности ксилитдегидро-геназы обеспечивал НАД+. Это еще раз подчеркивает заметную роль начальных стадий катаболизма Б-ксилозы в развитии дисбаланса НАДФН/НАДН, интенсифицирующего накопление ксилита (рисунок).
Достаточно высокие общие активности ксило-зоредуктазы и ксилитдегидрогеназы имели спи
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.