ПОЧВОВЕДЕНИЕ, 2015, № 5, с. 554-561
^=БИОЛОГИЯ ПОЧВ
УДК 631.4;574.472
МЕТАГЕНОМНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ КРАЙНЕАРИДНЫХ ПУСТЫННЫХ ПОЧВ КАЗАХСТАНА*
© 2015 г. О. В. Кутовая1, М. П. Лебедева1, А. К. Тхакахова1, Е. А. Иванова2, Е. Е. Андронов2
Почвенный институт им. В.В. Докучаева, 119017, Москва, Пыжевский пер., 7
2Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии, 196608, Санкт-Петербург, Пушкин-8, ш. Подбельского, 3
e-mail: langobard@mail.ru
Поступила в редакцию 23.05.2014 г.
Впервые проанализирован состав микробиомов корковых гор. AKL крайнеаридных почв Илийской котловины (восточная часть Казахстана), сформированных на засоленных и незасоленных пролю-виальных отложениях. Для описания разнообразия микроорганизмов в образцах почв в работе использован метод секвенирования нового поколения — пиросеквенирование (Roche/454 Life Sciences). Показано, что в сравниваемых разрезах доминирующее положение занимали бактерии филумов Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes, Verrucomicrobia, Acidobacteria, Bacteroidetes, которые являются представителями корового (общего) компонента микробиома почв. Отличительной чертой крайне-аридных почв является присутствие в составе тотальной ДНК 25—30% цианобактерий. В почве на засоленных отложениях доминировали представители семейств Rubrobacteraceae, Streptococcaceae и Caulobacteraceae, а также филума Firmicutes, а в почве на незасоленных гипсоносных отложениях — бактерии класса Acidobacteria подгруппы Gp3, семейства Methylobacteriaceae и класса Subdivision3 из филы Verrucomicrobia.
Ключевые слова: микробиом, почвенная ДНК, секвенирование, сообщества микроорганизмов, биоразнообразие, биологическая активность, биокорки.
DOI: 10.7868/S0032180X15050044
ВВЕДЕНИЕ
Биологическая активность крайнеаридных пустынных почв (впервые выделены и описаны на уровне типа Ефстифеевым [7]) признается одним из существенных факторов почвообразования и дифференциации их микропрофиля [3, 6, 29]. Дневная поверхность крайнеаридных почв покрыта так называемой пустынной мостовой, под которой развита пузырчатая корка и слоистая подкорка (гор. ЛКЬ — по [9]). Похожие по морфологии поверхностные горизонты пустынных почв рассматриваются как биокорки, поскольку представляют собой сложный биоценоз водорослей [10, 35], бактерий [34], микромицетов [18], иногда мхов и лишайников [22]. Эти поверхностные горизонты крайнеаридных почв составляют значительную долю живого покрова пустынного ландшафта и играют центральную роль в функционировании пустынных экосистем [36]. Они предохраняют почву от высыхания [22, 36] и ветровой эрозии [10, 24], за счет биологической активности микроорганизмов происходит фикса-
* Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 12-04-00990.
ция азота и углекислого газа атмосферы в районах с низким проективным покрытием высшими растениями, какими являются изучаемые крайнеа-ридные почвы Казахстана.
Целью исследования является характеристика прокариотного микробного сообщества крайнеаридных почв на основе анализа их метагенома.
Изучение генетического материала, полученного непосредственно из образцов окружающей среды, является основным подходом в почвенной метагеномике и мощным инструментом в экологии [19] для изучения и сравнения метаболических профилей сложных микробных сообществ [16, 21]. Кроме того, только при анализе тотальной ДНК, выделенной из почвенного образца, можно судить об истинном составе и структуре микробного сообщества и биологическом разнообразии изучаемого объекта.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ
Данная работа является продолжением исследований крайнеаридных почв, результаты которых представлены ранее [10].
Таблица 1. Химические свойства верхних горизонтов крайнеаридных почв
Горизонт Глубина, см pH водный (1 : 2.5) Гумус СО2 карб Гипс HCO- Cl— SO4- SO4- ток-сичн. Ca2+ Mg2+ Na+ K+ Сумма солей Сумма токсичных солей
% смоль(экв)/кг %
Разр. 3-06. Крайнеаридная почва на засоленных пролювиальных отложениях (Solonchak)
К (без гипса) 0- 3 9.1 0.18 3.56 0.12 0.42 2.79 0.44 0.00 1.35 0.35 3.22 0.02 0.251
tos (с гипсом) 0- 3 8.7 0.18 5.1 0.87 0.48 8.88 10.20 0.00 11.30 0.19 5.76 0.17 1.238
L 3- 10 8.7 0.39 4.14 0.17 0.24 7.14 5.30 0.00 5.80 0.13 5.76 0.11 0.790
0.23 0.62 0.49
Разр. 4-06. Крайнеаридная почва на незасоленных гипсоносных пролювиальных отложениях (Gypsisol)
K 0 -2 8.9 0 3.78 0.14 0.45 0.07 0.84 0.54 0.75 0.13 0.19 0.20 0.101 0.04
L 2- -5 8.8 0 1.89 0.23 0.35 0.07 1.82 0.87 1.30 0.13 0.22 0.32 0.159 0.05
Метагеном был изучен в почвах, расположенных на низких подгорных равнинах окружения Илийской котловины Восточного Казахстана и сложенных галечниково-песчано-суглинистыми аллювиально-пролювиальными (фаналлювиаль-ными) отложениями различной мощности, с так называемой, пустынной мостовой на поверхности. Для крайнеаридных почв под сплошным или прерывистым плащом щебня (desert pavement) с "пустынным загаром" (desert varnish) характерен ясно дифференцированный профиль с маломощными, но отчетливо выраженными горизонтами: палевой или белесоватой пузырчатой коркой, тонкослоистым подкорковым слоем, плотным маломощным красновато-бурым срединным горизонтом. Почвы карбонатны с поверхности и содержат гипс в верхних 30 см.
Область подгорных равнин хребта Улькен-Бо-гутты, обрамляющих Илийскую впадину, относится к аридным территориям со среднегодовым количеством осадков менее 150 мм и очень высокой степенью континентальности: годовая амплитуда температурных экстремумов достигает 82°. Средняя температура воздуха в холодный период (конец сентября—март) составляет —3.5°С, в теплый +21.2°C. В полосе подгорных равнин весенний максимум осадков отчетливо выражен. Почвы ежегодно промерзают до глубины 60—100 см и находятся в промерзшем состоянии несколько месяцев [12]. Особенности водного режима почв определяются малым количеством осадков в сочетании с интенсивным испарением, которое в пустынях суббореального пояса достигает 1000— 1300 мм/год [14]. Еще одной особенностью водного режима почв является его высокая контрастность. На фоне чрезвычайно низкой влажности
почв в течение года достаточно обычны короткие периоды сравнительно высокого увлажнения, вызывающие бурное развитие почвенных микроорганизмов и разнообразных биохимических процессов, продолжающиеся несколько дней [4, 5].
На основной поверхности, где распространены исследуемые почвы, высшие растения отсутствуют, а отдельные экземпляры ильинии (Ilynia regelii) обнаруживаются только по сайрам. Усилению аридности почв может способствовать пустынная мостовая, поверхность которой сильнее нагревается в теплый период, чем суглинистые или песчаные субстраты [8]. Судя по описаниям почв Восточного Казахстана и Монголии, сверхаридные или крайнеаридные почвы приурочены к ландшафтам с пустынной мостовой.
Анализ метагенома проводили в пузырчатых корковых гор. AKL, обладающих наибольшей биологической активностью (биокорки), которые являются диагностичными для крайнеаридных почв (по классификации 2004 г. [9]) из двух разрезов — 3-06 и 4-06, расположенных в 4 км друг от друга. Химические свойства верхних гор. AKL крайнеаридных почв представлены в табл. 1.
ДНК выделяли из 0.5 г почвы после механического разрушения с использованием стеклянных шариков в экстрагирующем буфере: 350 мкл раствора А (натрий-фосфатный буфер — 200 мМ; изотиоцианат гуанидина — 240 мМ; pH 7.0), 350 мкл раствора Б (Трис-HCl - 500 мМ; SDS -1% по массе к объему; pH 7.0) и 400 мкл смеси фенола с хлороформом (1 : 1). Разрушение образца проводили в течение 40 с при максимальной мощности (скорость 6500 об/мин. — 680 рад/с) с использованием 3D-вращения на гомогенизаторе Precellys 24 (Bertin Technologies, Франция). Полу-
ченный препарат центрифугировали при максимальной скорости 16000 об/мин (1700 рад/с) в течение 5 мин. Водную фазу отбирали и повторно экстрагировали хлороформом. ДНК осаждали, добавляя равный объем изопропилового спирта. После центрифугирования осадок промывали 70% этанолом и растворяли в воде при 65°С в течение 5—10 мин. Очистку ДНК проводили с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле с последующим выделением ДНК из геля методом сорбции на оксиде кремния [1, 31].
При конструировании и секвенировании ам-пликонных библиотек очищенный препарат ДНК (по 10—15 нг) использовался в качестве матрицы в реакции ПЦР (температурный профиль: 95°С - 30 с, 50°С - 30 с, 72°С - 30 с; всего 30 циклов) с добавлением полимеразы Encyclo ("Евро-ген", Россия) и универсальных праймеров к вариабельному участку V4 гена 168-рРНК — F515 (GT-GCCAGCMGCCGCGGTAA) и R806 (GGACTA-CVSGGGTATCTAAT) [17]. Кроме того, в прайме-ры вводили олигонуклеотидные идентификаторы для каждой пробы (20 идентификаторов) и служебные последовательности, необходимые для пиросеквенирования по протоколу фирмы "Roche" (Швейцария). Подготовку проб и секве-нирование выполняли на приборе GS Junior ("Roche", Швейцария) согласно рекомендациям производителя.
Таксономическую идентификацию нуклео-тидных последовательностей и сравнительный анализ микробных сообществ проводили с использованием интернет-ресурса VAMPS (Visualization and Analysis of Microbial Population Structures), доступного на сайте http://vamps.mbl.edu/. Классификацию последовательностей осуществляли с использованием банка данных RDP (Ribo-somal Database Project), доступного на сайте http://rdp.cme.msu.edu/.
В процессе анализа выполнялись следующие действия: разделение библиотек по идентификаторам, проверка качества секвенирования и фильтрация нуклеотидных последовательностей, объединение последовательностей в операционные таксономические единицы (ОТЕ) с использованием 97% порога сходства, выравнивание нуклеотид-ных последовательностей методом Uclust.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Используемые праймеры были сконструированы на основе последовательностей гена ^S-рРНК как бактерий, так и архей, что позволило провести комплексный анализ прокариотного сообщества.
Всего было секвенировано 5684 последовательности. Число последовательностей в образцах почвы составило 2644 (в образце почвы из ра
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.