ОКЕАНОЛОГИЯ, 2015, том 55, № 5, с. 770- 775
МОРСКАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 574.583:574.47(262.54)
МЕТАГЕНОМНЫЙ АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ БАКТЕРИАЛЬНОГО СООБЩЕСТВА АЗОВСКОГО МОРЯ © 2015 г. Д. Г. Матишов1, В. В. Стахеев1, Е. Л. Чирак2, Г. Ю. Глущенко1
Институт аридных зон Южного научного центра Российской академии наук, Ростов-на-Дону
e-mail: dmatishov@mail.com 2Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии,
Санкт-Петербург Поступила в редакцию 24.03.2014 г., после доработки 26.06.2014 г.
C использованием методов множественного параллельного секвенирования проведена оценка таксономического состава микроорганизмов Азовского моря. Показан реальный уровень биологического разнообразия микроорганизмов. Установлено, что по своей структуре прокариотное сообщество на всей акватории Азовского моря, включая Таганрогский залив, имеет типичные черты морского. Несмотря на мелководность водоема, сообщества микроорганизмов в Азовском море отчетливо дифференцированы на поверхностные и придонные кластеры.
DOI: 10.7868/S0030157415050123
Водная микрофлора — является важнейшим звеном функционирования водных экосистем, осуществляет трансформацию органических и минеральных веществ, во многом определяет первичную продукцию. Азовское море — высоко продуктивный водоем, изучение микрофлоры которого имеет уже почти столетнюю историю: первые сведения, характеризующие бактериальное население вод и донных отложений этого моря, были получены еще Книповичем [3], а позднее Исаченко [2], Буткевичем [1], Цыбань и Домчин-ской [6]. Применение методов молекулярной биологии, наряду с классическими микробиологическими подходами, открыло новые возможности исследования санитарно-микробиологического и экологического состояния воды и рыб Азовского моря. На основе секвенирования фрагментов генов были идентифицированы бактерии, выделенные методом посева из проб, взятых в Керченском проливе (12 штаммов) и предпроливье (5 штаммов), а также в одном из лиманов Азовского моря [12, 5, 4]. Всего к настоящему времени в микрофлоре вод и донных отложений Азовского моря описано 73 таксона родового и видового ранга, что, конечно же, не отражает истинного уровня биологического разнообразия бактерио-планктона этого водоема.
В последнее десятилетие в практику океанологических исследований активно внедряются методы геномного анализа [10, 11, 17, 15]. Результаты этих исследований позволили выявить некуль-тивируемые микроорганизмы, составить более полное представление о функционировании морских экосистем, раскрыть особенности путей трансформации основных биогенных элементов.
В представленной работе мы попытались дать общую характеристику метагенома микробиоты Азовского моря, определить таксономический состав бактериопланктона, играющего важную роль в функционировании экосистемы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом для работы послужили 10 проб воды, отобранные на пяти станциях с борта НИС "Денеб" 9—10 августа 2012 г. с поверхностного и придонного водных горизонтов из разных районов моря (рис. 1). Пробы с поверхности отбирали путем зачерпывания воды, с придонного горизонта — с использованием батометра Молчанова объемом 200 мл. Координаты станций отбора проб, их основные экологические параметры приведены в таблице.
Фиксацию проводили 80%-ным этанолом, до выделения ДНК хранили в холодильнике при +4°С. Выделение ДНК проводили по методике ферментативного лизиса с использованием лизо-цима и протеиназы с последующей фенол-хлороформной экстракцией [18].
Таксономический анализ проводили на основе вариабельного участка V4 гена 16S рРНК. Для ПЦР-реакции применяли универсальные прай-меры F515 GTGCCAGCMGCCGCGGTAA и R806 GGACTACVSGGGTATCTAAT [7] с добавлением олигонуклеотидных идентификаторов для каждой пробы (20 штук) и служебных последовательностей, необходимых для пиросеквени-рования по протоколу компании Roche. Используемые праймеры были сконструированы на основе анализа последовательностей как бактерий,
• 115
• 114 *
113
• 112
111
" ; ' 0 16 32 км
\ <ч
47° с.ш.
46°
45°
35°
36°
37°
38°
39° в.д.
Рис. 1. Карта-схема станций отбора проб.
так и архей. Параллельное множественное секве-нирование проводили на приборе GS Junior (Roche, USA) согласно рекомендациям производителя. Полученные библиотеки депонированы в БД "Short Reading Archive" (таблица).
Компьютерную обработку полученных в результате секвенирования нуклеотидных последовательностей, удаление из их состава меток и
праимеров осуществляли согласно методическим рекомендациям в приложении Ribosomal Database Project (RDP) Pipeline [8]. С использованием программы MOTHUR версии 1.22.2 [19] проводили выравнивание нуклеотидных последовательностей, построение матрицы генетических расстояний и кластерный анализ последовательностей с применением алгоритма average neighbor.
Координаты станций и гидрохимические характеристики отобранных проб
№ станции Координаты, град № пробы Глубина, м Индекс Шеннона Индекс ChaoI Идентификатор SRA
111 45.48621 с.ш. 36.74765 в.д. 111п 111пр 0 9.4 2.84 2.94 107.46 87.5 SRS622927 SRS622928
112 46.03707 с.ш. 36.98490 в.д. 112п 112пр 0 11.0 3.17 3.06 105.03 87.8 SRS622929 SRS622930
113 46.44108 с.ш. 37.22268 в.д. 113п 113пр 0 10.0 2.81 2.97 100.05 73.56 SRS622931 SRS622932
114 46.80628 с.ш. 37.45562 в.д. 114п 114пр 0 6.0 2.71 2.95 99 77.72 SRS622933 SRS622934
115 47.01557 с.ш. 38.74288 в.д. 115п 115пр 0 5.0 3.27 2.82 104 118.17 SRS622935 SRS622969
Примечание: п — поверхностные пробы, пр — придонные пробы.
(а)
шш — ^ рр
Ж _
%
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
111 112 113 114 115 % (б)
100
90 80 70 60
III
50
40
30 20 10
111 112 113 114 115
88 Actinobacteria H Planctomycetes
Ш Bacteroidetes ■ Proteobacteria
S Cyanobacteria И Verrucomicrobia Firmicutes Не дифф. эубактерии
Рис. 2. Доля различных бактериальных филогрупп в микрофлоре Азовского моря: (а) — поверхностный, (б) — придонный горизонт.
Далее проводили классификацию последовательностей на OTU (Operational Taxonomic Unit) с использованием критерия 97% сходства, вычислением индекса разнообразия Шеннона (H') и индекса обилия Chaol, которые позволяют судить об уровне биоразнообразия в сообществе и полноте его анализа: сравнение предполагаемого количества OTU при данных параметрах выборки с количеством экспериментально выявленных OTU [9].
Таксономическую идентификацию нуклео-тидных последовательностей и сравнительный анализ микробных сообществ проводили с использованием Интернет-ресурса VAMPS (Visualization and Analysis of Microbial Population Structures), доступного на сайте http://vamps.mbl.edu/. Классификацию последовательностей осуществляли с использованием базы данных RDP (Ribo-somal Database Project). На основе использования сайта VAMPS были получены таблицы, содержащие значение доли идентифицированных микроорганизмов в каждой пробе. Для построения дендрограммы родства микробных сообществ был проведен кластерный анализ последовательностей из всех проб с использованием алгоритма UPGMA и индекса Morisita-Horn.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ геномных фрагментов позволил выявить в метагеноме микроорганизмы, относящиеся к одному отделу архей и к 12 отделам, 26 классам, 47 порядкам, 78 семействам, 259 родам эу-бактерий.
Основу прокариотного сообщества Азовского моря в период проведения работ составляли представители отделов Рго1еоЬас1епа (от 23.95 до 66.41%), Вас1егсаёе1е8 (от 7.37 до 32.15%) и Суапо-Ьа^ейа (от 1.62 до 33.62%). В отдельных пунктах отмечена высокая доля бактерий отделов ЛсИпо-Ьа^ейа (до 18.45%), Firmicutes (до 8.18%), Р1апс-1ошусе1е8 (0.89-8.41%) и УегтасотюгоЬк (до 15.88%) (рис. 2).
Среди Proteobacteria доминируют представители классов Gammaproteobacteria (10.69— 55.51%) и ЛрИаргс^еоЬа^ейа (4.40—16.02%). Гам-мапротеобактерии являются хемогетеротрофами и их доля заметно выше в Таганрогском заливе и в центральной части Азовского моря, чем в пред-проливье — участке, менее богатом взвешенными органическими веществами. В этой группе преобладают (на отдельных станциях) роды ИаИва, Рзви^^отагта, РзвийоаЫвготопаз, ЛИвготопаз, МврШппЬас1вг и РяускгоЬаМвг, характерные для морских экосистем. Удивительно наличие в Азовском море рода РяускгоЬаМвг — бактерий обычно обитающих в холодных экосистемах. Микроорганизмы этой группы обнаружены преимущественно в поверхностных горизонтах и на отдельных
0
- 111пр
- 111п
--- 113пр
___ 112пр
- 114пр
___ 115пр
- 112п
- 115п
- 113п
- 114п
0.05
I_I
Рис. 3. Дендрограмма сходства микробных сообществ в разного типа пробах из Азовского моря (обозначения п и пр те же, что и в таблице).
станциях составляли от 1.67 до 27.61% (в среднем 12.45%).
Альфапротеобактерии представлены в сообществе относительно равномерно на акватории Азовского моря с преобладанием в поверхностном горизонте, что может быть обусловлено авто-трофными свойствами этой группы. Существенный вклад вносят бактерии родов Pelagibacter и ЕгуЛгоЬа^ег, доля которых возрастает в пробах по направлению от Керченского пролива к устью Дона, что по-видимому коррелирует с различными требованиями к содержанию органического вещества. Гетеротрофные бактерии Ре^Ьа^ег отличаются невысокой требовательностью к наличию свободного азота. Эритробактерии — фо-тогетеротрофы, содержащие бактериохлорофилл а и способные обеспечить значительную часть своих метаболических потребностей за счет фотосинтеза.
Филогруппа Вае1его1ёе1е8 объединяет гетеротрофных бактерий, обладающих широким спектром физиологических адаптаций, что позволяет им осваивать разнообразные экологические ниши, а мультиферментные системы обеспечивают утилизацию разнообразных субстратов в качестве источников углерода и энергии.
В микрофлоре Азовского моря широко представлены бактерии класса Flavobacteria, составляющие от 1.57 до 30.40% на отдельных станциях. В поверхностном горизонте значительную долю составляют также флавобактерии рода ОгашеНа, относительное содержание которых увеличивается по направлению к Таганрогскому заливу. Бактерии этого рода играют важную роль в процессах биодеградации высокомолекулярных соединений
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.