ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.26
МЕТАНОТРОФНЫЕ БАКТЕРИИ ГРЯЗЕВЫХ МИКРОВУЛКАНОВ
В ПОЙМАХ СЕВЕРНЫХ РЕК
© 2013 г. С. Э. Белова1, И. Ю. Ошкин1, М. В. Глаголев2, 3 4, Е. Д. Лапшина3, Ш. Ш. Максютов5, С. Н. Дедыш1, *
Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва 2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
3Югорский государственный университет, Ханты-Мансийск 4Институт лесоведения Российской академии наук, пос. Успенское 5National Institute for Environmental Studies, Цукуба Поступила в редакцию 25.03.2013 г.
Одним из потенциально значимых, но малоизученных источников поступления метана в атмосферу являются грязевые "микровулканы" или холодные сипы, широко распространенные в поймах северных рек. Полевые исследования грязевых микровулканов в пойме реки Мухриной Ханты-Мансийского АО показали, что потоки метана из этих природных объектов на порядки превосходят его эмиссию c эквивалентных по площади участков болот зоны средней тайги. Микробные сообщества, развивающиеся вокруг таких сипов, формируются в условиях высоких концентраций доступного метана, низких температур (3—5°С) и около-нейтральных величин рН. Молекулярная идентификация метанокисляющих бактерий в составе такого сообщества с помощью анализа гена pmoA, кодирующего мембранную метанмонооксигеназу, показала присутствие метанотрофов как I, так и II типов (классы Gammaproteobacteria и Alphaproteobacteria соответственно) с преобладанием метанотрофов I типа. В числе последних выявлены организмы, близкие к Methylobacter psychrophilus и Methylobacter tundripaludum, обитателю застойных вод Crenothrixpolyspora, а также ряд метанотрофов, принадлежащих к неизвестным таксонам. Сравнение ростовых характеристик двух выделенных из ила сипа метанотрофов показало более активный рост Methylobacter sp. CMS7 в диапазоне температур 4—10°С, а Methylocystis sp. SB12 — при 20°С. Полученные результаты подтверждают ведущую роль метанотрофных представителей Gammaproteobacteria в контроле эмиссии метана из холодных речных сипов.
Ключевые слова: холодные метановые сипы, психрофильные метанотрофы, Methylobacter, Crenothrix, pmoA гены.
Б01: 10.7868/80026365613060049
Метан является важным парниковым газом в климатической системе, определяющим фотохимию атмосферы: по величине прямого потенциала глобального потепления он в 39 раз (в расчете на единицу концентрации и для периода 20 лет) превышает углекислый газ [1]. По современным представлениям, основным природным источником метана являются болота (113 Мт СН4 год-1 из 530 Мт СН4 год-1 суммарного поступления этого газа в атмосферу) [2].
Недавно было высказано предположение, что вторыми по мощности среди всех естественных источников метана являются геологические источники, глобальный поток из которых составляет 53 ± 11 Мт СН4 год-1 [3]. Эти источники связа-
* Автор для корреспонденции (e-mail: dedysh@mail.ru).
ны с углеводородсодержащими седиментацион-ными бассейнами: природный газ выходит из них в атмосферу через вышележащую почву как повсеместно, так и по отдельным каналам, заканчивающимся макросипами (грязевыми вулканами и другими типами сипов) и микросипами. Поток СН4, выбрасываемый грязевым вулканом, может составлять величины до 1 кТ • год-1 [4].
В южных регионах (Азербайджан, Бирма, Италия, Ост-Индия, о. Тринидад, Туркмения, о. Ява) грязевые вулканы не только были давно открыты, но и уже столетие назад весьма хорошо изучены в плане объема и периодичности выброса газов (в том числе и СН4) - см., например, [5]. К настоящему времени основная информация по эмиссии метана из грязевых вулканов собрана в ряде работ [6, 7] (к последней работе существует важный
комментарий [8]). Достаточно подробную сводку по геологическим источникам метана в Европе дал Этиоп [9], а в качестве наиболее полных обзоров в глобальном разрезе можно порекомендовать [4, 3]. В последнее время метановые сипы были обнаружены и на севере в районах таяния "вечной" мерзлоты [10].
Поскольку в России площади нефтеносных и газоносных осадочных пород весьма велики, то здесь можно ожидать и значительные площади распространения сипов. В частности, грязевые "микровулканы" (с диаметром жерла порядка первых сантиметров) были обнаружены нами в западно-сибирской средней тайге — в поймах небольших рек, являющихся притоками Оби и Иртыша недалеко от места их слияния [11]. Микробные сообщества, развивающиеся вокруг таких грязевых микровулканов, представляют значительный интерес. Высокие концентрации доступного метана, низкие температуры (3—5°С) и около-нейтральные величины рН создают условия для активного развития психрофильных метано-трофных микроорганизмов, однако нам не известны какие-либо микробиологические исследования, выполненные в континентальных метановых сипах.
Настоящая работа ставила своей целью оценку скоростей эмиссии СН4 из метановых сипов Об-ско-Иртышской поймы и идентификацию ключевых микробных агентов, ответственных за снижение потока метана из этих источников.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Район проведения исследований. Полевые исследования распространения грязевых микровулканов и интенсивности эмиссии из них метана проводили в августе—сентябре 2009 г. в долине реки Мухриной и ее притоков, стекающих в пойму Иртыша в районе международного полевого стационара "Мухрино", расположенного в зоне средней тайги Западной Сибири на левобережной террасе Иртыша в 30 км к юго-юго-западу от г. Ханты-Мансийска (60°53' с.ш., 68°42' в.д.). Об-ско-Иртышская пойма в районе исследований представлена преимущественно долгопоемными лугами с многочисленными водоемами и протоками, которые во второй половине мая заполняются водой в результате подпора со стороны Оби и Иртыша. При этом заливаются и долины стекающих в них малых рек и ручьев. После падения уровня воды в Оби и Иртыше, вода из долин ручьев уходит, что приводит к быстрому развитию луговой растительности и формированию водя-ноосоковых (Сагех aquatilis) лугов и пойменных осоковых болот [12].
Измерение эмиссии метана. Основным способом измерения эмиссии метана из грязевых мик-
ровулканов был метод вытеснения газом воды из мерного цилиндра. На грязевой микровулкан устанавливалась воронка (таким образом, чтобы она почти полностью находилась под водой), служащая уловителем выделяющегося газа. Поверх воронки помещался мерный цилиндр (таким образом, чтобы его нижний край также находился под поверхностью воды), заполненный водой, которая вытеснялась выходившим из микровулкана газом. Динамика выхода газа фиксировалась во времени. Вторым способом измерения потока метана из микровулканов был классический метод статических камер [13, 14].
Концентрация СН4 в пробах измерялась на хроматографе "Кристалл-5000" ("Хроматек", Йошкар-Ола, Россия).
Отбор образцов для анализа. Для идентификации метанотрофных бактерий, развивающихся в местах выхода газа на поверхность, использовали образцы ила, отобранные в пойме реки Мухри-ной из безымянного грязевого микровулкана (60°53.358' с.ш., 68°42.486' в.д.) в сентябре 2009 г. Электропроводность поверхностного слоя воды над микровулканом определяли с использованием портативного кондуктометра SG-3 ("Mettler Toledo", Швейцария). Величину рН воды измеряли портативным рН-метром SG-2 ("Mettler Toledo", Швейцария).
Часть отобранного ила была использована в качестве инокулята для получения накопительной культуры метанотрофных бактерий, тогда как другая его часть была заморожена при —20° C для проведения молекулярных анализов.
Молекулярная идентификация метанотрофных бактерий. Выделение препаратов тотальной ДНК производили с использованием набора FastDNA SPIN kit for soil ("Bio101", США) в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя. Выделение ДНК проводили в 3-х повторностях, из 3-х навесок анализируемого ила по 0.5 г каждая. Полученные образцы ДНК хранили до анализа при —20°C.
Полученные из ила экстракты тотальной ДНК использовали в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР-амплификация была выполнена с праймерами A189f (GGNGACTGG-GACTTCTTG) и A682r (GAASGCNGAGAAGAAS-GC), специфичными для гена pmoA, кодирующего полипептид, несущий активный центр мембранной ММО [15]. В качестве положительного контроля использовали образцы ДНК метанотроф-ной бактерии Methylocystis heyeri Н2Т. ПЦР проводили на термоциклере PE GeneAmp PCR System 9700 ("Perkin-Elmer Applied Biosystems", США). Реакционная смесь содержала 0.5—1 мкл ДНК, по 1 мкл праймеров A189f и A682r, 50 мкл MasterMix ("Promega"), стерильную воду до общего объема V = 100 мкл. Температурный профиль реакции
был следующим: начальная денатурация (1 мин при 94°C), затем 33 цикла, включающих денатурацию ДНК (1 мин при 94°C), отжиг праймеров (1 мин при 55°C) и элонгацию (1 мин при 72°C), за которыми следовала терминальная элонгация (7 мин при 72°C). Проверку продуктов ПЦР осуществляли путем их электрофореза в 1.2% агароз-ном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием и визуализацией продуктов реакции с помощью УФ-трансиллюминатора. Продукты 3-х независимых реакций, полученные с матричной ДНК 3-х экстрактов ДНК, смешивали и использовали для последующего клонирования. Последнее проводили с использованием набора для клонирования pGem-T Easy Vector System II ("Promega") в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Скрининг рекомбинант-ных клонов осуществляли методом сине-белой селекции. Дополнительную проверку отобранных клонов на наличие клонированного фрагмента определенной длины (около 530 пар оснований) проводили путем прямой амплификации этих фрагментов — вставок с использованием вектор-специфичных праймеров T7 и Sp6 ("Promega"). Температурный профиль реакции был следующим: начальная денатурация (1 мин при 94°C); затем 35 циклов, включающих денатурацию ДНК (1 мин при 94°C), отжиг праймеров (1 мин при 52°C) и элонгацию (1.5 мин при 72°C); за которыми следовала терминальная элонгация (7 мин при 72°C). Полученные продукты ПЦР проверяли путем электрофореза и производили финальный отбор клонов, несущих фрагменты ДНК корректного размера. Полученные клоны использовали для выделения
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.