МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 6, с. 817-824
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 579.841[41+42]:581.557"324"
МЕТАНОТРОФЫ И МЕТИЛОБАКТЕРИИ ОБНАРУЖЕНЫ В ТКАНЯХ ДРЕВЕСНЫХ РАСТЕНИЙ В ЗИМНИЙ ПЕРИОД
© 2004 г. Н. В. Доронина, Е. Г. Иванова, Н. Е. Сузина, Ю. А. Троценко*
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино
Поступила в редакцию 30.09.03 г.
Образцы семян, почек и хвои деревьев, отобранные в зимний период при температуре от -11 до —17°С, исследовали на присутствие метилотрофной микрофлоры. На ультратонких срезах тканей хвои голубой ели выявлены бактерии, близкие по морфологии розовоокрашенным метилобактери-ям. Из образцов семян и почек липы, почек сирени, клена и яблони, а также хвои сосны и голубой ели в чистые культуры выделены метилобактерии, отнесенные к родам МеШу1оЬа^егшт и Рагасос-сш на основании морфологии, энзимологического анализа и ДНК-ДНК-гибридизации. Из образцов почек липы и хвои голубой ели изолированы чистые культуры метанотрофов, отнесенные к роду Ме1ку\осу&и& на основании морфологии, энзимологического анализа, ДНК-ДНК-гибридизации, а также филогенетического анализа последовательностей гена ртоА, кодирующего мембрансвязан-ную метанмонооксигеназу. Таким образом, аэробные метилотрофные бактерии постоянно ассоциированы с растениями. При этом колонизация филлосферы хвойных и лиственных пород деревьев весной в начале вегетационного периода роста обусловлена развитием метилотрофных бактерий, перезимовавших внутри растительных тканей.
Ключевые слова: метилобактерии, метанотрофы, семена, почки и хвоя деревьев.
Известно, что аэробные метилотрофные бактерии, использующие метан (метанотрофы) или его окисленные и замещенные производные (метилобактерии), часто встречаются в филлосфере и ризосфере растений [1, 2]. Поскольку метанол, метиламины, метилгалиды и сероуглерод являются обычными летучими продуктами метаболизма растений, метилотрофные бактерии могут успешно конкурировать с другими микроорганизмами, ассоциированными с растениями. Более того, становится очевидным, что метилотрофные бактерии являются фитосимбионтами, поскольку образуют фитогормоны - цитокинины и ауксины [1, 3]. В частности, показано стимулирующее влияние метанотрофов и метилобактерий на рост и развитие гнотобиотических растений, культивируемых in vitro [4, 5]. Известно, что розовоокра-шенные факультативно метилотрофные бактерии (РОФМ) рода Methylobacterium колонизируют с высокой плотностью листовую поверхность многих растений в теплое время года [1, 6]. Недавно методом in situ гибридизации с 16S pPHK-специфичными олигонуклеотидными пробами продемонстрирована локализация бактерий рода Methylobacterium в тканях почек сосны (Pinus sylvestris L.) [7]. Из ризосферы растений семейства бобовых (Leguminosae) выделены бесцветные метилобактерии Methylobacterium nodulans, вызы-
* Адресат для корреспонденции (e-mail: trotsenko@ibpm.push-chino.ru).
вающие образование клубеньков и экспрессиру-ющие NodA гены [2]. Ранее из филло- и ризосферы кукурузы нами были выделены бесцветные метилобактерии Methylovorus mays [8] и Paracoc-cus kondratievae [9], синтезирующие фитогормоны - цитокинины и ауксины [1, 3].
Недавно Романовской с соавт. [6] выдвинуто предположение, что в природных условиях РОФМ бактерии колонизируют весной листья растений, попадая на них с почвенными частицами, переносимыми воздушно-пылевыми потоками. Напротив, наши предварительные наблюдения свидетельствовали в пользу постоянной связи метилотрофных бактерий с растениями независимо от времени года (сезона). Основная цель данной работы - экспериментальная проверка наличия метанотрофов и метилобактерий в тканях древесных растений в зимний период.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследований. Объектами исследований служили образцы семян и почек липы (Tilia cordata L.), почек сирени (Syringia glauca L.), клена (Acer platanoides L.), яблони (Malus domestica L.), хвои сосны (Pinus sylvestris L.) и голубой ели (Picea pungens var. glauca L.), отобранные в феврале 2002 и 2003 гг. (t = -11...-17°C) в Пущино (Московская обл.). Для сравнительного анализа ДНК использовали типовые штаммы метилотрофных бактерий Methylobacterium extorquens NCIMB
9399T, Paracoccus denitrificans ATCC 17741T, Meth-ylobacter bovis 98, Methylomonas methanica S1, Me-thylomicrobium album BG8, Methylococcus capsula-tus Bath, Methylosinus trichosporium OB3b, Methylo-cystis parvus OBBP, Methylocystis echinoides 2 BKM B-2128.
Выделение накопительных и чистых культур метилотрофных бактерий. 0.5 г образцов растений помещали в качалочные колбы объемом 700 мл с 200 мл минеральной среды "K" или "П" и инкубировали на качалке (120 об/мин) при 29°C в течение 5 сут. Метилобактерии выращивали на жидкой и агаризованной среде "K" [8] с 0.5% (об/об) метанола или 0.3% (в/об) метиламина, метанотро-фов - на жидкой и агаризованной среде "П" в атмосфере CH4 и воздуха (1 : 1) [10]. Полученные накопительные культуры метанотрофов и мети-лобактерий дважды пересевали. Для выделения чистых культур использовали метод истощающего посева накопительных культур на чашки с агаризованной средой "K" или "П". Изолированные колонии пересевали на скошенный агар. О чистоте выделенных культур метилотрофных бактерий судили по однородности колоний и клеток при световой и электронной микроскопии (тотальные препараты и срезы). Чистоту метано-трофных культур дополнительно оценивали по отсутствию роста на органических средах (МПА, глюкозо-картофельный агар).
Фенотипический анализ. Для получения ультратонких срезов образцы растений и бактерий фиксировали в растворе глутарового альдегида в 0.05 М какодилатном буфере (pH 7.2) в течение 1 ч при 4°C, трижды отмывали в том же буфере и дополнительно фиксировали в 1%-ном OsO4 в течение 4 ч при 4°C. После обезвоживания в серии спиртов препараты заключали в эпоксидную смолу Epon-812. Ультратонкие срезы монтировали на опорные сеточки, затем контрастировали ура-нилацетатом и свинцом [11]. Для негативного контрастирования препаратов клеток использовали 0.3%-ный раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты (pH 7.2). Полученные препараты просматривали в электронном микроскопе JEM 100B ("JEOL", Япония): ультратонкие срезы растительных тканей и бактериальных клеток при ускоряющем напряжении 80 кВ, а негативно контрастиро-ванные клетки - при 60 кВ. Активности индикаторных и ключевых ферментов путей Q-метаболизма определяли известными методами [12].
Анализ ДНК. Выделение ДНК проводили, как описано ранее [8]. Для ПЦР-анализа тотальной ДНК, выделенной из накопительных культур метанотрофов в первом пассаже микрофлоры образцов растений на среде "П", использовали олигонук-леотидные праймеры к генам мембрансвязанной (pmoA) и растворимой (mmoX) метанмонооксиге-назы (MMO), согласно описанным ранее процеду-
рам [13, 14]. Качественный состав накопительных культур метанотрофов определяли, используя для ПЦР-амплификации группоспецифичные праймеры [13, 15, 16]. ПЦР-амплификацию проводили на ДНК термоциклере Hybaid (Англия) в режиме: 1 цикл - 95°C, 2 мин; 25 циклов - 94°C, 40 с; 55°C, 40 с; 72°C, 40 с; последний цикл - 72°C, 4 мин. Реакционная смесь (30 мкл) содержала: 10 мМ трис-HCl буфер; 68 мМ (NH4)2SO4; 1 мг/мл БСА; 0.1% Твин-80; 2.5 мМ MgCl2; 5 пмоль соответствующих праймеров; 0.5 мкл ДНК образца. Пробирки выдерживали 5 мин при 95°C, быстро охлаждали, помещая в лед, затем добавляли 0.2 мкМ каждого дНТФ и 1 Е 7од-ДНК-полимеразы. Продукты реакции разделяли методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле. В качестве контроля использовали препараты ДНК метанотрофных бактерий Methylobacter bovis 98, Methylomonas methanica S1, Methylomicrobium album BG8, Methylococcus capsulatus Bath, Methylosinus trichosporium OB3b, Methylocystis parvus OBBP.
ДНК-ДНК-гибридизацию проводили на капроновых фильтрах "Хийу калур" (Эстония), как описано ранее [8], используя для введения метки в ДНК дезокси[1',2',5'-3Н]-цитидинтрифосфат и набор ферментов для "ник-трансляции" фирмы "Am-ersham" (Англия). В качестве реперных штаммов для ДНК-ДНК-гибридизации метилобактерий использовали типовые культуры Methylobacterium extorquens NCIMB 9399T и Paracoccus denitrificans ATCC 17741t, а метанотрофов - Methylocystis echinoides 2 ВКМ В-2128Т.
ПЦР-продукт pmoA гена очищали на легкоплавкой агарозе с использованием агаразы, согласно рекомендациям фирмы производителя ("Fermentas", Литва). Секвенирование ПЦР-фраг-мента pmoA проводили на автоматическом секве-наторе CEQ2000 XL (Beckman Coulter, USA), используя набор ферментов CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing kit ("Beckman Coulter", USA). Предварительный филогенетический скрининг сходства определенных в данной работе нуклео-тидных и транслированных аминокислотных последовательностей гена pmoA по базе данных GeneBank [NCBI] проводили с помощью пакета программ BLAST [http://ncbi.nlm.nih.gov]. Для транслирования нуклеотидных последовательностей в аминокислотные использовали программу ORF Finder [http://ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html]. Для более точного определения филогенетического положения изучаемых штаммов нуклеотидные и транслированные аминокислотные последовательности фрагментов гена pmoA выравнивали вручную с помощью программы CLUSTAL W [http://www.genebee.msu.su/clustal] с соответствующими последовательностями, доступными из последней версии базы данных NCBI Database Project. Построение укорененного филогенетического дерева на основании транслированных ами-
Таблица 1. Некоторые свойства метилобактерий, выделенных на среде с метанолом из различных образцов растений, отобранных в зимний период
Объект Изолят Путь С1 -метаболизма % ДНК-ДНК-гомологии с реперами
M. extorquens NCIMB 9399т P. denitrificans ATCC 17741т
Почки липы РОФМ Сериновый 41 7
бесцветные кокки РБФ 5 28
Семена липы РОФМ Сериновый 42 7
бесцветные кокки РБФ 6 26
Почки сирени РОФМ Сериновый 22 8
бесцветные кокки РБФ 4 38
Почки яблони РОФМ Сериновый 63 7
Почки клена РОФМ Сериновый 29 7
Хвоя сосны РОФМ Сериновый 51 6
бесцветные кокки РБФ 7 27
Хвоя ели РОФМ Сериновый 34 5
Примечание. РОФМ - розовоокрашенные факульт
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.