научная статья по теме METHYLOPILA TURKIENSIS SP. NOV. – НОВЫЙ АЭРОБНЫЙ ФАКУЛЬТАТИВНО МЕТИЛОТРОФНЫЙ ФИТОСИМБИОНТ Биология

Текст научной статьи на тему «METHYLOPILA TURKIENSIS SP. NOV. – НОВЫЙ АЭРОБНЫЙ ФАКУЛЬТАТИВНО МЕТИЛОТРОФНЫЙ ФИТОСИМБИОНТ»

МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 4, с. 456-465

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ

УДК 579.841

METHYLOPILA TURKIENSIS SP. NOV. - НОВЫЙ АЭРОБНЫЙ ФАКУЛЬТАТИВНО МЕТИЛОТРОФНЫЙ ФИТОСИМБИОНТ

© 2015 г. Н. В. Агафонова, Е. Н. Капаруллина, Н. В. Доронина, Ю. А. Троценко1

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской Академии Наук, Пущино Пущинский государственный естественно-научный институт, Пущино Поступила в редакцию 03.12.2014 г.

Из филлосферы Bougainvillea sp. L. выделена новая факультативно метилотрофная бактерия, штамм Side1T. Изолят представлен аэробными, грамотрицательными, подвижными, неспорообразующи-ми палочками, размножается бинарным делением. Использует метанол, моно- и триметиламин, ограниченный спектр полиуглеродных субстратов в качестве источников углерода и энергии, не использует метан и дихлорметан. Растет при рН 6.0—9.0 (оптимально рН 7.0), температуре 20—40°C (оптимально 28—30°C) и 0—2.5% NaCl в среде. В жирнокислотном составе клеток преобладают цис-11-октадеценовая (С18:1ю7с), 11-метил-октадеценовая (C18:ro7c11Me), стеариновая (C18:0) кислоты. Доминирующие фосфолипиды — фосфатидилэтаноламин, фосфатидилхолин, фосфатидилгли-церин и дифосфатидилглицерин. Доминирующий убихинон Qi0. Окисляет метанол и метиламин соответствующими дегидрогеназами. Реализует изоцитратлиазонегативный вариант серинового пути. В ассимиляции аммония участвуют глутаматдегидрогеназа и глутаматный цикл (глутаматсин-таза и глутаминсинтетаза). Синтезирует индолпроизводные, сидерофоры, солюбилизирует нерастворимые фосфаты. Содержание Г + Ц в ДНК 65.4 мол. % (Тпл). Нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК штамма Sidel обнаружила высокое сходство (97—98%) с таковыми у представителей рода Methylopila (M. musalis MUSAT и M. capsulata IM1T), но уровень ДНК-ДНК гомологии с этими культурами составил 32—37%. Совокупность полученных данных позволила отнести штамм Side1T к новому виду Methylopila turkiensis sp. nov. (ВКМ В-2748Т = DSM 27566Т).

Ключевые слова: Methylopila turkiensis sp. nov., аэробные метилобактерии, фитосимбиоз.

DOI: 10.7868/S0026365615040023

Известно, что метанол, метилированные амины и другие С1-соединения являются естественными продуктами метаболизма растений и источниками углерода и энергии для аэробных метилобактерий, которые, в отличие от метанотрофов, не растут на метане [1]. В настоящее время описано более 50 таксонов аэробных метилобактерий, выделенных из природных и антропогенных биотопов [1, 2]. Ранее было показано, что филлосфера и ризосфера растений колонизована метилобактериями разных таксономических групп, снабжающих растения различными биоактивными соединениями [1]. В соответствии с www.bacterio.org род Methylopila включает пять видов аэробных, грамотрицатель-ных, непигментированных факультативных метилобактерий, реализующих изоцитратлиазоне-гативный вариант серинового пути окисления С1-соединений: Methylopila capsulata IM1T [3], M. helvetica DM9T [4], М. jiangsuensis JZL-4T [5],

1 Автор для корреспонденции (e-mail: trotsenko@ib-pm.pushchino.ru).

М. musalis MUSAT [6], M. oligotropha 239 5AT [7]. Большинство представителей этого рода выделены из активных илов и почв, и только Methylopila musalis MUSAT был выделен из плода банана Musa paradisiaca L. [6].

Цель работы — таксономическая и физиолого-биохимическая характеристика нового штамма аэробных метилобактерий, выделенных из фил-лосферы Bougainvillea sp. L.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. Штамм Side1T был выделен из листьев растения Bougainvillea sp. L., отобранных в окрестностях города Сиде (Турция). Навески (5 г) листьев помещали в колбу Эрлен-мейера (750 мл) с 200 мл среды "К" и 0.5% (об./об.) метанола. Среда "К" содержала (г/л): KH2PO4 - 2.0; (NH4)2SO4 - 2.0; NaCl - 0.5; MgSO4 • 7H2O - 0.1; FeSO4 • 7H2O - 0.002; pH 7.4. Накопительные и чистые культуры выделяли как описано ранее [6]. Чистоту культуры проверяли

световой и электронной микроскопией, а также по однородности колоний на агаризованных средах с метанолом и глюкозой/пептоном.

Типовые представители рода Methylopila, М. jiangsuensis JZL-4T (=ВКМ B-2555T = DSM 22718T = ATCC 05406T), М. capsulata IM1T (=ВКМ B-1606T = ATCC 7007161), М. helvetica DM9T (=ВКМ B-2189T = CIP106788T), М. musalis MUSAT (=ВКМ B-2646T = DSM 24986T = CCUG 61696T), М. olig-otropha 2395AT (=ВКМ B-2788T = CCUG 63805T) были использованы в качестве референтных культур.

Изучение культуральных и физиолого-биохими-ческих свойств изолята. Для описания колоний, изучения морфологии и подвижности клеток штамм Side1T выращивали на агаризованной среде "К" ("Difco", США, 2%). Способность изолята восстанавливать нитраты анализировали в жидкой среде, где аммонийный азот был заменен KNO3 (1 г/л) после 1, 2 и 3 сут инкубации. Гидролиз крахмала оценивали по реакции с раствором Люголя после выращивания культуры на агаризованной среде "К" с добавлением 0.2% (в/об.) растворимого крахмала.

Наличие оксидазы определяли, используя 1% (в/об.) раствор тетраметил-р-фенилендиамин ди-гидрохлорида. Активность каталазы выявляли, нанося 3%-ный раствор перекиси водорода на штрих культуры, выращенной на агаризованной среде.

Температурный диапазон роста определяли, выращивая культуру в жидкой среде "К" с метанолом в герметично закрытых флаконах на качалке (120 об./мин) при температуре 4—43°С. Рост изолята при различных значениях концентрации метанола (0.1-7.0%, об./об.), солености (0-3% NaCl) и рН исследовали на среде "К". Значения рН устанавливали добавлением 1 М NaOH и 5 н HCl, оптимум рН определяли по удельной скорости роста штамма в экспоненциальной фазе при исходных значениях рН 5.0-10.0 среды.

При изучении способности изолята использовать различные органические соединения в качестве источника углерода и энергии в минеральную среду вместо метанола вносили 0.05-0.3% (в/об.) испытуемого вещества, инокулировали культурой и инкубировали 14 сут на качалке при оптимальной температуре. Все летучие вещества вносили в количестве 0.5% по объему.

Для определения спектра используемых субстратов и выявления некоторых биохимических свойств исследуемого штамма использовали также API тесты (API 20Е, API 20NE; "Biomerieux", Франция), следуя инструкции производителя. Рост в атмосфере метана, дихлорметана или H2/CO2/O2 анализировали, как описано ранее [8].

При исследовании способности культуры использовать различные источники азота в среду "К" вместо (NH4)2SO4 вносили эквимолярные по азоту количества тестируемых веществ.

Чувствительность к антибиотикам определяли с помощью дисков ("Bioanalyse", Турция).

Образование индола из L-триптофана анализировали с реактивом Сальковского [9]. Калибровочную кривую строили со стандартными растворами индолилуксусной кислоты.

Фосфатсолюбилизирующую активность определяли в среде "К" с нерастворимым Ca3(PO4)2 в качестве единственного источника фосфора, как описано ранее [10].

Способность к синтезу сидерофоров выявляли универсальным химическим методом [11] на жидкой и агаризованной среде "К" без FeCl3 с реактивом хром-азуролом S (CAS). Катехольный тип сидерофоров тестировали в культуральной жидкости штамма согласно методу Arnow [12].

Электронная микроскопия. Электронную микроскопию клеток проводили, как описано ранее [13].

Хемотаксономический анализ. Убихиноны экстрагировали из лиофильно-высушенных клеток, очищали по методу Коллинса [14] и анализировали на масс-спектрометре Finnigan МАТ 8430 MS (Германия).

Жирнокислотный состав клеток, выращенных на агаризованной среде с метанолом в течение 48 ч, определяли известным методом [15]. Фос-фолипидный состав клеток анализировали двумерной тонкослойной хроматографией [16].

Энзимологический анализ проводили в бесклеточном экстракте, как описано ранее [17]. Активность у-глутамилметиламид(у-ГМА)лиазы и ^метилглутамат(^МГ)лиазы определяли по скорости образования формальдегида из у-ГМА и N-МГ соответственно [6]. Активность ферментов выражали в наномолях прореагировавшего субстрата или образованного продукта за 1 мин в пересчете на 1 мг белка. Количественное определение белка проводили методом Лоури [18].

Выделение и анализ ДНК. ДНК выделяли с использованием набора ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep ("Zymo Research", США) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя.

Г + Ц состав ДНК определяли тепловой денатурацией на спектрофотометре "Beckman DU-8B" (США) при скорости нагрева 0.5°С/мин и рассчитывали, используя уравнение: мол Г + Ц = (Tren х х 2.08) - 106.4 [19]. В качестве стандарта использовали ДНК Escherichia coli K-12. Уровень ДНК-ДНК гомологии штамма Side1T и типовых представителей рода Methylopila определяли методом ДНК-ДНК реассоциации [20].

1 мкм

I_I

ь

Рис. 1. Морфология клеток штамма Side1T (негативное контрастирование).

Ген 16S рРНК амплифицировали ПЦР, используя универсальные для 16S рДНК бактерий праймеры 27f и 1492r [21].

Фрагмент гена mxaF (547 п.н.), кодирующего большую субъединицу классической пирролохи-нолинхинон (PQQ)-зависимой метанолдегидро-геназы грамотрицательных бактерий, амплифи-цировали, используя праймеры 1003f и 1561r, согласно ранее описанному протоколу [22].

Фрагмент гена mauA (257 п.н.), кодирующего малую субъединицу метиламиндегидрогеназы, которая катализирует окисление метиламина до формальдегида у галофильных (Methylophaga spp.) и негалофильных метилобактерий (Methylobacteri-um, Paracoccus, Methylophilus, Methylobacillus), амплифицировали, используя праймеры f1 и r1 [23].

Продукты реакции разделяли методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле. Выделение и очистку фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы проводили на колонках с использованием набора Zymoclean Gel DNA Recovery Kit ("Zymo Research", США), согласно инструкции фирмы-производителя. Секвенирование ПЦР-фрагментов проводили с помощью набора реактивов CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing kit (Beckman Coulter, США) на анализаторе CEQ2000 XL ("Beckman Coulter", США).

Филогенетический анализ. Предварительный филогенетический скрининг сходства нуклеотид-ных последовательностей генов 16S рРНК, mxaF и mauA штамма Side1T проводи

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»