МИКРОБИОЛОГИЯ, 2011, том 80, № 5, с. 700-706
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 579.841-26
METHYLOVOR US MENTHALIS - НОВЫЙ ВИД АЭРОБНЫХ ОБЛИГАТНЫХ МЕТИЛОБАКТЕРИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С РАСТЕНИЯМИ © 2011 г. Н. В. Доронина, Е. Н. Капаруллина, Ю. А. Троценко1
Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина
РАН, Пущино Поступила в редакцию 03.11.2010
Из ризопланы полевой мяты выделен штамм бактерий (ММ), использующих метанол в качестве единственного источника углерода и энергии. Представлен грамотрицательными бесцветными подвижными палочками. Спор и простек не образует, размножается бинарным делением, в витаминах и факторах роста не нуждается. Строгий аэроб, уреазо-, оксидазо- и каталазоположительный. Реализует КДФГ-вариант рибулозомонофосфатного пути. Обладает активностью НАД+-зависимой де-гидрогеназы 6-фосфоглюконата и ферментами глутаматного цикла. Отсутствуют активности а-ке-тоглутаратдегидрогеназы и ферментов глиоксилатного шунта (изоцитратлиазы и малатсинтазы). В жирнокислотном составе клеток преобладают пальмитиновая : 0) и пальмитолеиновая (Q6: i) кислоты. Доминирующие фосфолипиды — фосфатидилэтаноламин, фосфатидилглицерин и фос-фатидилхолин. Доминирующий убихинон — Q8. Образует индол из триптофана. Содержание Г + Ц в ДНК 54.5 мол. % (ТЛп). По данным секвенирования гена 16S рРНК, штамм ММ проявил высокое (98—99%) сходство с Methylovorus glucosotrophus ВКМ В-1745Т и Methylovorus mays ВКМ В-2221Т, но уровень ДНК—ДНК гомологии с этими культурами составил только 40 и 58% соответственно. Отнесен к новому виду Methylovorus menthalis sp. nov. (ВКМ В-2663Т).
Ключевые слова: Methylovorus menthalis, аэробные облигатные метилобактерии, рибулозомонофос-фатный путь, ризоплана.
Совокупность корневой системы с почвой представляет собой сложную экологическую нишу, заселенную полезными, вредными и нейтральными для растений микроорганизмами. Активная секреция клетками корня различных веществ обеспечивает питательными субстратами микроорганизмы, образующие с ним прочные ассоциации как внутри корневых тканей, так и на корневой поверхности (ризоплане), а также в почве, непосредственно окружающей корни (ризосфере). Метанол, формальдегид, формиат, метилированные амины и другие С1-соединения являются естественными продуктами метаболизма растений [1, 2]. Аэробные метилобактерии активно используют эти С1-соединения как ростовые субстраты. Показано, что филлосфера растений колонизована аэробными ме-тилотрофными бактериями различных таксономических групп, которые являются фитосимбионта-ми, синтезирующими фитогормоны (ауксины и ци-токинины) и витамин В12 [1, 3].
В противоположность филлосферным, метило-трофы ризосферы и ризопланы охарактеризованы в гораздо меньшей степени. Из ризосферы риса вы-
1 Адрес для корреспонденции (e-mail: trotsenko@ibpm. push-chino.ru).
делен ограниченно-факультативый метилотроф с рибулозомонофосфатным путем метаболизма Me-thylophius rhizosphaerae [4]. Из клубеньков африканского бобового растения Crotalaria podocarpa выделен азотфиксирующий, имеющий гены нодуляции, факультативный "сериновый" метилотроф Methy-lobacterium nodulans [5]. В целом, однако, метило-бактерии ризосферы и ризопланы растений пока мало изучены.
Цель данной работы — таксономическая и фи-зиолого-биохимическая характеристика нового штамма аэробных метилобактерий, выделенных из ризопланы полевой мяты.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объект исследования и условия культивирования. Корневище мяты полевой (Mentha arvensis L.) было выкопано из почвы окрестностей г. Пущино в сентябре 2008 г. Корень трижды отмывали стерильной дистиллированной водой и помещали в колбу Эрленмейера (750 мл) с 200 мл среды "К" и 0.5% (об./об.) метанола. Среда "К" содержала (г/л): KH2PO4 - 2.0; (NH4)2SO4 - 2.0; NaCl - 0.5; MgSO4 • 7H2O - 0.1; FeSO4 • 7H2O - 0.002; pH 7.4. После трех пассажей в течение 2 сут на качалке
(180 об./мин) при 29°С суспензию накопительной культуры метилобактерий высевали истощающим посевом на агаризованную ("Difco", США, 2%) среду "К" с метанолом. Изолированные колонии метилобактерий пересевали на скошенный агар, переносили в жидкую среду и вновь высевали истощающим посевом на агаризованную среду. Реизо-лированную колонию метилобактерий пересевали на скошенный агар. Чистоту выделеной культуры контролировали световой и электронной микроскопией, а также по однородности колоний на ага-ризованной среде с метанолом.
Изучение культуральных и физиолого-биохимиче-ских свойств изолята. При описании колоний, изучении морфологии и подвижности клеток штамм ММ выращивали на агаризованной среде "К". Способность изолята восстанавливать нитраты анализировали в жидкой среде "К", где аммонийный азот был заменен KNO3 (1 г/л), после 1, 2 и 3 сут инкубации. Образование индола из триптофана определяли колориметрически, используя реактив Сальковского [6]. Калибровочную кривую строили со стандартными растворами индолилуксусной кислоты. Гидролиз крахмала оценивали по реакции с раствором Люголя после выращивания культуры на агаризованной среде "К" с добавлением 0.2% (в./об.) растворимого крахмала. Наличие ок-сидазы определяли, используя 1% (в./об.) раствор тетраметил-р-фенилендиамин дигидрохлорида. Активность каталазы выявляли, нанося 3%-ный раствор перекиси водорода на штрих культуры, выращенной на агаризованной среде.
Температурный диапазон роста определяли, выращивая культуру в жидкой среде с метанолом в герметично закрытых флаконах на качалке (120 об./мин) при температуре 7—40°С. Рост изолята при различных значениях рН исследовали на среде "К" в диапазоне рН 5.5—10.0. Значения рН устанавливали добавлением 1 М NaOH.
При изучении способности изолята использовать различные органические соединения в качестве источника углерода и энергии в минеральную среду вместо метанола вносили 0.3% (в./об.) испытуемого вещества, инокулировали аликвотой культуры стационарной фазы роста и инкубировали 14 сут на качалке при оптимальной температуре. Все летучие вещества вносили в количестве 0.5% по объему.
Для определения спектра используемых субстратов и выявления некоторых биохимических свойств исследуемого штамма использовали также Api тесты (Api 20Е, Api 20NE; "Biomerieux", Франция), следуя инструкции производителя. Рост в атмосфере метана или H2 + CO2 + O2 анализировали как описано ранее [7].
При исследовании способности культуры использовать различные источники азота в среду "К" вместо (NH4)2SO4 вносили эквимолярные по азоту
количества тестируемых веществ. Потребность изолята в витаминах изучали на среде "К", в которую вносили: тиамин • HCl— 50 мкг/л, биотин — 50 мкг/л, В12 — 20 мкг/л или дрожжевой автолизат 0.01% по объему. Контролем служила среда без витаминов.
Образование муравьиной кислоты в культу-ральной жидкости анализировали с использованием препарата формиатдегидрогеназы из метило-трофных дрожжей Candida boidinii ("Boehringer", Германия).
Электронная микроскопия. Электронную микроскопию целых клеток и ультратонких срезов проводили как описано ранее [8].
Хемотаксономический анализ. Жирнокислотный и фосфолипидный состав клеток изолята ММ определяли как описано ранее [9]. Убихиноны экстрагировали из сухих клеток, очищали по методу Кол-линса [10] и анализировали на масс-спектрометре Finnigan МАТ 8430 MS (Германия). Энзимологиче-ский анализ проводили известными методами [11].
Выделение и анализ ДНК. ДНК выделяли и очищали по методу Мармура [12]. Г + Ц состав ДНК определяли тепловой денатурацией на спектрофотометре "Beckman DU-8B" (США) при скорости нагрева 0.5°С/мин. В качестве стандарта использовали ДНК Escherichia coli K-12. Уровень ДНК/ДНК-гомологии штамма ММ и типовых культур рода Me-thylovorus определяли методом ДНК/ДНК-реассо-циации [13]. Ген 16S рРНК амплифицировали ПЦР, используя универсальные для 16S рДНК прокариот праймеры 27f: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' и 1492r: 5'-AAGGAAGGTGATCCAGCTCGT-3' [14]. Фрагмент гена mxaF (550 п.н.), кодирующего большую субъединицу классической пирролохинолин-хинон (PQQ)-зависимой метанолдегидрогеназы грамотрицательных бактерий, амплифицировали, используя праймеры 1003f и 1561r, согласно ранее описанному протоколу [15].
Продукты реакции разделяли методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле. Выделение и очистку фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы проводили на колонках с использованием набора Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System ("Prome-ga", США), согласно инструкции фирмы-производителя. Секвенирование ПЦР-фрагментов проводили при помощи наборов BigDye® Terminator v1.1 и капиллярного анализатора ABI PRISM® ('Applied Biosystems", США).
Филогенетический анализ. Предварительный филогенетический скрининг сходства нуклеотид-ных последовательностей генов 16S рРНК и mxaF штамма ММ по базе данных GeneBank [NCBI] проводили с помощью пакета программ BLAST [http:// ncbi.nlm.nih.gov]. Для более точного определения филогенетического положения нуклеотидные последовательности генов 16S рДНК и mxaF выравнивали вручную c таковыми таксономически близких референтных штаммов с помощью программы
1 мкм
I_I
Рис. 1. Морфология штамма ММ (негативное контрастирование).
CLUSTAL W [http://www.genebee.msu.su/clustal] и с соответствующими последовательностями, доступными из последней версии базы данных NCBI Database Project. Укорененное филогенетическое дерево строили по методу neighbor-joining (NEIGHBOR) в программе TREECON [16]. Эволюционное расстояние рассчитывали как число замен на 100 нуклеотидов. Статистическую достоверность ветвления оценивали с помощью "bootstrap-анали-за" 1000 альтернативных деревьев, используя соответствующую функцию программы TREECON.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Морфология. Штамм ММ представлен палочковидными (0.5-0.6 х 1.2-1.3 мкм) клетками (рис. 1), имеющими грамотрицательный тип клеточной стенки. Подвижные монотрихи, капсул и спор не образуют, размножаются бинарным делением. Колонии на агаризованной среде "К" с метанолом точечные (до 0.5 мм в диаметре), прозрачные, бесцветные, округлые, с выпуклым профилем и ровным краем, с гладкой блестящей поверхностью, однородной структуры
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.