ГЕНЕТИКА, 2009, том 45, № 3, с. 349-353
ОБЩАЯ ГЕНЕТИКА
УДК 575.224.46:535-31:579.842.11
МЕТИЛЕНОВЫЙ СИНИЙ КАК СУПРЕССОР ГЕНОТОКСИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО ИЗЛУЧЕНИЯ ДЛИНОЙ ВОЛНЫ 300-400 нм
© 2009 г. В. А. Чистяков1, М. А. Сазыкина1, М. А. Коленко1, Г. Г. Червяков2, А. В. Усатов1
Научно-исследовательский институт биологии при Южном Федеральном университете,
Ростов-на-Дону 344090; e-mail: vladimirchi@yandex. ru 2Таганрогский технологический институт при Южном Федеральном университете,
Таганрог 347928 Поступила в редакцию 20.12.2007г.
Ультрафиолетовое излучение длиной волны 300-400 нм, характерное для солнечного света у земной поверхности, вызывает повреждение ДНК, опосредованное переносом энергии на 02 с переходом последнего в синглетное состояние. В связи с этим перехватчики активных форм кислорода (АФК) являются потенциальными протекторами от генотоксического действия этого вида излучения. Исследования показали, что краситель метиленовый синий в дозах, на несколько порядков отличающихся от токсичных для человека, способен полностью подавлять SOS-ответ, вызванный УФ длиной волны 300-400 нм у E. coli.
Генотоксические эффекты разных частей спектра ультрафиолетового света (УФ) опосредованы действием различных механизмов. Главными продуктами повреждения ДНК светом с длиной волны 200-280 нм (ультрафиолет C) являются пиримидиновые димеры, образующие при поглощении квантов света ДНК [1]. Ультрафиолет А (320-400 нм) и В (280-320 нм), не поглощающийся нуклеиновыми кислотами, способен индуцировать в клетках каскад фотореакций, сопровождающихся генерацией активных форм кислорода (АФК). При этом, если пиримидиновые димеры эффективно репарируются системами безошибочной эксцизионной репарации, то продукты свободно-радикальной атаки ДНК, особенно такие, как сшивки с белками и поперечные сшивки, репарируются гораздо слабее с широким участием систем ошибочной репарации. Поэтому ближний ультрафиолет, несмотря на меньшую энергию его квантов, является серьезным индуктором рака кожи у человека [2-5]. Большая часть солнечного ультрафиолета, достигающего земной поверхности, представлена излучением длиной волны 300-400 нм [5]. Этот диапазон, по-видимому, является оптимальным для подбора защитных веществ. На практике для защиты от канцерогенного действия солнечной радиации используются в основном "sunscreen" продукты - вещества, экранирующие кожу от света [6]. Их эффективность ограничена целым рядом факторов - в основном невозможностью создать стабильную пленку необходимой толщины. Решение проблемы защиты от негативных
эффектов солнечной радиации должно быть основано на комплексном подходе, интегрирующем работу самых разных механизмов. Последнее определяет актуальность поиска соединений, способных защищать клетку от генотоксических эффектов ультрафиолета А и В. Очевидно, что чем более широким будет перечень таких веществ, тем больше появится возможностей для создания высокоэффективных комплексных препаратов.
В ряде публикаций описан антиоксидантный эффект широко применяемого в биологии и медицине красителя - метиленового синего (К,К,К',№-тетраметилтионина хлорид), относящегося к группе тиазинов. Это вещество способно хорошо проникать в живые клетки и эффективно "перехватывать" активные формы кислорода в концентрациях, на несколько порядков отличающихся от токсических [7]. В то же время описана фотосенсибилизирующая активность метиленового синего [8]. Таким образом, исследование способности этого соединения модифицировать деструктивные эффекты, вызываемые фотоиндукцией активных форм кислорода, представляет несомненный интерес.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве системы для оценки генотоксично-сти исследуемого воздействия был применен вариант 808-1их-теста, использованный ранее для изучения антимутагенных эффектов ряда природных соединений [9-11]. Репортером 808-отве-та служил 1их-оперон. Использовали штамм РТ-1
Таблица 1. Динамика индукции SOS-ответа штамма E. coli РТ-1 после облучения дозой УФ (300-400 нм) 390 Дж/м2
Время после облучения, мин Интенсивность биолюминесценции штамма PT-1, ед. прибора* Фактор индукции, I5
До облучения 0.60 ± 0.05 0
30 1.62 ± 0.09 0 7**
60 4.83 ± 0.28 4.2**
90 6.05 ± 0.73 8.4**
120 7.52 ± 0.78 9.8**
150 5.69 ± 0.36 7.5**
где Ьк - интенсивность люминесценции контрольной пробы; Ье - интенсивность люминесценции опытной пробы.
Признаком достоверности эффекта 808-ин-дукции считали статистически достоверное превышение Ье над Ьк, оцениваемое по £-крите-рию.
Показатель антимутагенного потенциала (А, %) вычисляли по формуле:
А
= (м»,
(2)
* Среднее из четырех значений. ** Отличия от контроля статистически достоверны, t < 0.05.
(E. coli C600(pPLS-1)), несущий плазмиду pPLS-1, в которой оперон биолюминесценции находится под контролем SOS-промотора [12]. Для контроля эффектов, не связанных с SOS-индукцией, использовали штамм PT-5 (C600(pPLS-5)), lux-опе-рон которого находится под контролем конститутивного промотора [13].
Штаммы E. coli выращивали на среде LB. В 50 мл среды вносили 0.1 мл ночной культуры E. coli и инкубировали в термостате в течение 1 ч при 37°С. 1 мл культуры помещали в пластмассовую чашку Петри без крышки диаметром 40 мм, которую облучали ультафиолетовым светом с длиной волны 300-400 нм на установке, использующей в качестве излучателя ртутную лампу низкого давления (HG-125). Лампа помещена в фокусе параболического отражающего зеркала, и УФ-поток, с целью снижения угла рассеяния, передавался к облучаемому объекту через алюминиевую направляющую систему. Это позволило сформировать осесимметричный и равномерный поток излучения на расстояниях от 20 см до 2 м, в котором минимальная площадь облучаемой поверхности составляет 80 х 80 мм, а неравномерность (при отклонении от оси на 50 мм) не превышала 20%.
Раствор метиленового синего (ч.д.а., "Диа-м, Россия") в дистиллированной воде добавляли до необходимой конечной концентрации за 30 мин до облучения.
После облучения суспензии микроорганизмов выдерживали в течение необходимого времени (см. табл. 1) при температуре 25°С, затем измеряли люминесценцию при помощи люминометра ЛТ-01 (Россия).
Фактор индукции SOS ответа (I) вычисляли по формуле:
Is = L _i,
(1)
где Ia - фактор индукции SOS-ответа исследуемым воздействием в присутствии протектора; Ip -фактор индукции SOS-ответа исследуемым воздействием.
Все эксперименты проводили в трех независимых повторностях.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Результаты по развитию SOS-ответа, вызванного у E.coli ультрафиолетовым излучением с длиной волны 300-400 нм во времени, приведены в табл. 1. Максимальный эффект развивается через 120 мин после облучения. Фактор индукции достигает при этом величины 9.8, затем начинает снижаться. Утверждать, что наблюдаемое увеличение интенсивности свечения опосредовано именно SOS-индукцией, позволяет отсутствие достоверных изменений этого параметра у штамма РТ-5, lux-оперон которого находится под контролем конститутивного промотора (данные не приводятся). Таким образом, экспозиция в течение 120 мин после облучения является оптимальной для изучения протекторов.
Как видно из табл. 2, увеличение дозы ультрафиолетового излучения исследуемого диапазона ведет к увеличению эффекта до достижения максимального показателя фактора индукции, равного 9.7 (390 Дж/м2). Дальнейший рост дозы ведет к постепенному уменьшению эффекта. Дозы, превышающие 3120 Дж/м2, не дают достоверного роста биолюминесценции штамма PT-1. Достоверного изменения свечения штамма PT-5 для доз от 65 до 7800 Дж/м2 зарегистрировано не было, что позволяет утверждать, что полученные эффекты обусловлены индукцией SOS-ответа, а не общей активацией биоэнергетики бактериальных клеток.
Дальнейшее увеличение дозы ведет к подавлению свечения обоих штаммов.
Таким образом, зависимость фактора SOS-индукции от дозы ультрафиолетового излучения с длиной волны от 300 до 400 нм в полулогарифмическом масштабе имеет вид колоколообразной кривой, представленной на рисунке, с максимумом в
k
районе 390 Дж/м2. Эта доза является оптимальной для изучения эффектов защиты от изучаемого воздействия. Данные по модификации метилено-вым синим 808-индукции, вызываемой УФ (300400 нм), представлены в табл. 3. Концентрации 0.01-1 нМ не оказывают статистически достоверного влияния на уровень фактора индукции. Для больших концентраций регистрируется протекторный эффект. Эффективность защиты мети-ленового синего увеличивается с увеличением его дозы, достигая максимума (подавление S0S-ин-дукции до уровня, статистически неотличимого от фонового) в концентрации 1000 нМ. Дальнейшее десятикратное увеличение концентрации не ведет к снижению эффекта.
ОБСУЖДЕНИЕ
S0S-lux-тест создавался как метод количественной оценки генотоксических эффектов [11]. Нами была предложена модификация, позволяющая вычислять истинные значения S0S-индукции в присутствии веществ, подавляющих активность бактериальной люциферазы [13]. Способность теста регистрировать линейный рост интенсивности S0S-ответа при увеличении дозы воздействий и веществ, непосредственно взаимодействующих с ДНК, подтверждена экспериментально [12, 14]. Нелинейный характер дозовой зависимости, полученной в рамках данного исследования, по-видимому, обусловлен сложностью свободноради-кальных процессов, ведущих к повреждению ДНК при действии УФ на бактериальные клетки. Отметим, что нелинейный характер зависимостей доза/эффект отмечается и для ряда других мутагенов, в основе действия которых лежит генерация АФК, в частности, для кислорода под давлением [15, 16]. Тем не менее регистрируемая в наших экспериментах десятикратная индукция S0S-ответа позволяет использовать этот параметр для количественного учета протекторной активности.
Метиленовый синий относится к группе тиази-новых красителей. История клинического применения этого соединения насчитывает более 100 лет. Первоначально его использовали для лечения метгемоглобинемии как врожденного, так и токсикологического происхождения. В конце XX столетия было обнаружено, что метиленовый синий обладает широким адаптогенным потенциалом, в частности, защищает клетки от д
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.