МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2010, том 44, № 1, с. 170-173
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 577.113.4:579.835.12
МЕТИЛИРОВАНИЕ CpG-ДИНУКЛЕОТИДОВ ГЕНОМА Helicobacter pylori ПРИ ПОВЫШЕНИИ КОНЦЕНТРАЦИИ МЕТИОНИНА
© 2010 г. В. М. Пехов1*, Н. Ю. Краснова2, А. М. Мазур1, О. В. Селезнева2, Е. Б. Прохорчук1,
К. Т. Момыналиев2
Центр "Биоинженерия" Российской академии наук, Москва, 117312 2Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, Москва, 119992
Поступила в редакцию 13.03.2009 г. Принята к печати 02.06.2009 г.
Ключевые слова: Helicobacter pylori, метионин, метилирование ДНК, Каизо.
CpG-METHYLATION IN Helicobacter pylori GENOME: HIGH METHIONINE CONCENTRATION IMPACT, by V. M. Pekhov1*, N. Yu. Krasnova2, A. M. Mazur1, O. V. Selezneva2, E. B. Prokhortchouk1, K. T. Momynaliev2 (1Centre "Bioengineering", Russian Academy of Sciences, Moscow, 117312 Russia, *e-mail: vas.pekhov@gmail.com; 2Research Institute for Physico-Chemical Medicine, Ministry of Health and Human Services of Russian Federation, Moscow, 119992 Russia).
Key words: Helicobacter pylori, methionine, DNA methylation, Kaiso.
Helicobacter pylori — грамотрицательная микро-аэрофильная бактерия, которую ассоциируют со многими гастродуоденальными заболеваниями [1]. Для генома H. pylori характерна выраженная макро-и микрогетерогенность [2, 3], что обеспечивает высокую способность бактерии к адаптации. Предполагается, что эта геномная гетерогенность обусловлена высокой частотой межштаммовых и внутриге-номных рекомбинационных событий [4]. Но, очевидно, также, что наряду с рекомбинациями, значительную роль в формировании генетической гетерогенности играют мутации de novo [5]. Процессы метилирования-дезаминирования цитозина вносят весомый вклад в мутагенез, так как у H. pylori имеется свыше 20 систем рестрикции-модификации типа II, в состав которых, как правило, входят одна или две метилтрансферазы. При этом известно, что скорость дезаминирования цитозина возрастает в 2—4 раза при метилировании его в 5-м положении [6]. С другой стороны, систем репарации нуклеотидных ошибок в опубликованных геномах H. pylori не аннотировано. Помимо идентификации своего генетического материала и защиты его от чужеродного, связанного с процессами рестрикции-модификации, метилирование ДНК регулирует репарацию, репликацию и влияет на вирулентность бактерий [7]. Например, мутанты Salmonella typh-imurium по метилтрансферазам абсолютно невирулентны. Поэтому, очевидно, изменения в степени
5 Эл. почта: vas.pekhov@gmail.com
метилирования генома H. pylori могут влиять на адаптационные возможности бактерии также и на эпигенетическом уровне.
Таким образом, геном H. pylori, по-видимому, — уникальный субстрат для модификаций, связанных с процессами метилирования-дезаминирования. Для проверки этого предположения мы использовали модельную систему, которая основана на использовании повышенной концентрации метиони-на. Метионин — предшественник S-аденозилмети-онина, донора метильных групп в клетке, поэтому можно предположить, что избыток этой аминокислоты в среде приведет к увеличению числа метилированных остатков цитозина в составе геномной ДНК и, как следствие, к возрастанию числа переходов цитозина в тимин. Использованные нами концентрации метионина физиологичны.
Для определения статуса метилирования CpG-динуклеотидов мы предлагаем метод, который базируется на использовании ранее описанной нами аффинной смолы на основе белка Каизо [8]. В структуре этого белка содержится домен "цинковые пальцы", обладающий сродством к метилированным CpG и, в еще большей степени, к CpGpCpG-мотивам [9]. Суть метода заключается в том, что метилированные последовательности геномной ДНК избирательно связываются смолой Каизо, после чего производится анализ представленных фрагментов на микроматрице ДНК.
Цель настоящей работы — во-первых, показать возможность применения данного метода для опре-
Влияние метионина на уровень метилирования генома H. pylori
Экспериментальный штамм Число генов, метилирование которых увеличивается Число генов, метилирование которых уменьшается Общее число генов, на уровень метилирования которых влияет метионин
Инкубация 48 ч
199-1мМ-48 71 (4.5%) 102 (6.4%) 173 (10.9%)
199-100мМ-48 109 (6.9%) 107 (6.7%) 216 (13.6%)
Инкубация 2 недели
199-1мМ-2недели 30 (1.9%) 110 (6.8%) 140 (8.8%)
199-10мМ-2недели 39 (2.5%) 264 (16.2%) 303 (19%)
Примечание. Все величины даны в сравнении с контролем. Общее число ОРС на ДНК-матрице — 1590.
деления статуса метилирования CpG-динуклеоти-дов генома H. pylori и, во-вторых, определить влияние метионина на степень метилирования генома H. pylori. В работе использовали штамм J99, в котором активны, по меньшей мере, две метилазы, переносящие метильную группу на пятый углеродный атом цитозина. Одна из них, Hpy99III (ОРС 1050), метилирует по сайту GCGC), вторая — Hpy99XI (ОРС 435) — по сайту ACGT [10]. Таким образом, 5-метилцитозин присутствует в геноме H. pylori в составе CpG-динуклеотидов. Выделенную геномную ДНК из штаммов H. pylori фрагментировали, обра-ботывая ее ультразвуком. ДНК связывали со смолой Каизо in vitro в 25 мМ HEPES-буфере, pH 7.9, содержащем 0.1 M KCl, 12.5 мМ MgCl2 и 10% глицерин, после чего ДНК последовательно элюировали буферами с возрастающей концентрацией KCl от 0.2 М до 1 М с шагом 0.1 М. Смолу Каизо получали по методике, описанной ранее [8]. В этой же работе показано, что фракция метилированной ДНК, специфически связываемая смолой Каизо, элюируется преимущественно при 0.6 М KCl. Поэтому для последующего анализа использовали элюаты этой фракции. Мы создали ДНК-матрицы, содержащие 1590 открытых рамок считывания (ОРС) H. pylori штаммов J99 и 26695. Праймеры для амплификации каждой ОРС получены от компании "Eurogentec" (Бельгия). После амплификации ПЦР-продукты наносили на нейлоновые мембраны (Hybond — N+) с помощью автоматического репликатора Qpix 2 ("Genetix", Великобритания). Исследуемую ДНК метили [a-33P]dATP с использованием набора Megaprime DNA Labelling Systems ("Amersham Biosciences", Великобритания). После гибридизации и отмывок ДНК-матрицы экспонировали с накопительным экраном ("Molecular Dynamics", Германия) и сканировали на приборе Typhoon Trio ("Amersham Biosciences", Великобритания) с разрешением 50 мкм.
В соответствии с задачей работы, мы в первую очередь изучили возможность использования смолы Каизо для оценки статуса метилирования CpG-динуклеотидов генома H. pylori. Для этого сравнивали профили гибридизации геномной ДНК штамма
J99 (контроль) и геномной ДНК после связывания со смолой Каизо (199-элюат). При анализе профиля гибридизации опытного штамма (199-элюат) сигнала гибридизации для гена 421, по сравнению с контролем, не наблюдалось. Таким образом, все гены можно разделить на две группы, в одной из которых сигналов гибридизации в опыте не было, в другой — были. Пример типичного результата гибридизации приведен на рисунке.
Для проверки специфичности смолы Каизо по отношению к CpG-динуклеотидам проанализировали CG-состав обеих групп генов. Среднее число CpG-динуклеотидов в первой группе генов составляет 33.4 на один ген, а CpGpCpG-тетрануклеоти-дов — 1.6. При этом среднее число CpG во второй группе генов составляют 41.6, а среднее число CpGpCpG — 2.1 на один ген. Различия между двумя группами генов статистически значимы (р < 0.05; гетероскедастический Т-тест). Ранее в опытах по связыванию смолой Каизо геномной ДНК из клеточной линии colo320 (АТСС № CCL-220.1™) нами показано, что элюаты фракции 0.6 М обогащены метилированными последовательностями промотора гена р16, но не гипометилированными последовательностями промотора актина [8]. Таким образом, очевидно, что появление сигналов гибридизации элюатов со смолы Каизо обусловлено наличием метилированных CpG-динуклеотидов в геноме H. pylori.
На втором этапе, для проверки предположения о влиянии метионина на метилирование генома, мы провели две серии опытов. В первом из них штаммы инкубировали в течение 48 ч на стандартной питательной среде (контроль) и на средах, дополнительно содержащих 1 и 100 мМ метионина (экспериментальные штаммы 199-1мМ-48 и 199-100мМ-48). Во втором опыте клетки H. pylori пассировали в среде, содержащей 1 и 10 мМ метионина в течение 2 недель (экспериментальные штаммы 199-1мМ-2 недели и 199-10мМ-2 недели). После этого определяли статус метилирования генов каждого экспериментального штамма по описанному выше методу.
Сравнительные результаты представлены в таблице. Как видно, в целом, с увеличением концен-
172
ПЕХОВ и др.
Результат сканирования участка ДНК-матрицы после гибридизации (а); б — увеличенный фрагмент. 1 — Нет сигналов гибридизации; 2 — есть сигналы гибридизации.
трации метионина увеличивается степень его воздействия: растет число как гиперметилированных генов, так и гипометилированных. При инкубации в течение 48 ч по мере увеличения концентрации число гиперметилированных генов увеличивается в большей степени, в то же время при двухнедельной инкубации — увеличивается число гипометилированных генов. В число генов, оказавшихся метилированными после инкубации в течение 48 ч, входят гены, отвечающие за подвижность и механизм хемотаксиса клетки; гены, кодирующие белки клеточного деления, транспортной системы, метаболизма жирных кислот и фосфолипидов, а также энергетического обмена. К числу гиперметилированных в экспериментальном штамме 199-100мМ-48 относится также ряд генов, участвующих в процессах репликации и рекомбинации (xerC, xerD, ruvC) и некоторые другие. Обращает также на себя внимание то, что гиперметилироваными оказывается целый ряд генов, кодирующих компоненты систем рестрикции-модификации ДНК (hsdM, mod, DDEM, datl). Среди генов, метилирование которых изменяется при длительной инкубации (2 недели), можно выделить гены, участвующие в геномных перестройках — XerC- и XerD-подобные интегразы и ген-аналог транспозазы, ген, кодирующий ДНК-хеликазу, и некоторые другие. В ходе работы нами не обнаружено общих гиперметилированных генов при разной (48 ч и 2 неде
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.