БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2012, том 29, № 6, с. 454-457
УДК 575.172.1
МЕТИЛИРОВАНИЕ ГИСТОНА H3 В ГОЛОВНОМ ГАНГЛИИ МЕДОНОСНОЙ ПЧЕЛЫ В УСЛОВИЯХ ДЕФИЦИТА ЭНДОГЕННЫХ КИНУРЕНИНОВЫХ МЕТАБОЛИТОВ ТРИПТОФАНА
© 2012 г. Т. Г. Зачепило, А. И. Вайдо, Н. Г. Камышев, Н. Г. Лопатина
Институт физиологии им. И.П. Павлова, 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6; электронная почта:polosataya2@mail.ru Поступила в редакцию 29.06.2011 г.
После доработки 01.08.2012 г.
С использованием медоносной пчелы Apis mellifera L. в качестве модельного объекта выявлены особенности функционирования эпигенетических механизмов в головном ганглии интактных и испытывающих дефицит кинуренинов насекомых. Дефицит кинуренинов вызывали системными инъекциями (дорсально в торакс) 0.15% раствора аллопуринола (ингибитора триптофан-диоксигеназы). Иммуногистохимическим методом (антитела к метилированному по Lys4 гистону Н3) изучали метилирование по Lys4 гистона H3 в головном ганглии насекомого. У интактных пчел зонами с максимальным количеством сигнала были ламина зрительных долей и вторичный ассоциативный ней-ропиль (малые клетки Кеньона внутри каликса грибовидных тел, преимущественно ольфакторной модальности). При дефиците кинуренинов окраска этой зоны составила 80% нормы (денситомет-рия, t-критерий Стьюдента). По данным Gupta et al. (2010), метилирование гистона H3 по Lys4 в поле СА1 гиппокампа стимулировало формирование памяти у грызунов (крысы Sprague-Dawley). Таким образом, полученные данные позволяют говорить о существенной модификации эпигенетических механизмов (метилирование гистона H3), опосредующих формирование памяти, в условиях дефицита эндогенных кинуренинов. Дефицит эндогенных кинуренинов характерен для нейропато-логий человека (эпилепсия и др.).
Ключевые слова: рецепторы Z-глутамата, кинуренины, эпигенетика, медоносная пчела.
Известно, что головной ганглий медоносной пчелы (Apis mellifera L.) содержит гетерогенную популяцию рецепторов глутамата, вовлеченных в ольфакторное обучение (в процессы памяти) [1, 2]. В условиях однократной процедуры обучения (сочетание обонятельного раздражителя с пищевым подкреплением) активация ионотроп-ных рецепторов (NMDA- и не-NMDA (AMPA)-подтипов) способствует формированию кратковременной, а метаботропных рецепторов I, II, III групп (mGluR) — долговременной памяти. При этом фармакологический профиль рецепторов у пчел и млекопитающих оказался сходным. Ионо-тропные рецепторы каинатного подтипа также участвуют в формировании кратковременной памяти пчелы, однако степень их участия зависит от возраста и хемотипа особей [3, 4]. В наших экспериментах системные инъекции каината (10-9—10-4 М) стимулировали формирование кратковременной памяти лишь в первые 7 дней жизни имаго. В дальнейшем (возраст 15—30 сут) введение каиновой кислоты в широком ряду концентраций (10-9— 10-2 М) не влияло на формирование памяти у пчел дикого типа. Мутация snow laranja, локализованная в гене триптофан-диоксигеназы, вызывает у пчел дефицит кинурениновых метаболитов
триптофана (лигандов рецепторов глутамата). Инъекция таким пчелам 10-5 М каината приводила к достоверному увеличению числа особей, ответивших условной реакцией (вытягиванием хоботка), на предъявление обонятельного стимула через 1 мин после однократного сеанса обучения. Проведенный нами Вестерн-блот-анализ гомоге-натов головного мозга пчелы с помощью антител к МЯ1, 1ш01иЯ1, С1иЯ5/6/7 (крыса) выявил в них присутствие соответствующих белков (~110, 140, 110 кДа) [5]. У млекопитающих размер этих белков равен примерно 115, 140, 90—110 кДа. Предварительный сравнительный анализ нуклеотид-ных и аминокислотных последовательностей АМРА-каинатных рецепторов медоносной пчелы и млекопитающих, также проведенный нами, выявил высокую степень гомологии (более 90%) между ними. Полученные данные позволили сделать вывод о присутствии соответствующих рецепторов глутамата в головном ганглии пчелы. Ранее и^сИ й а1. [6] получили кДНК, кодирующую каинат-селективные белки дрозофилы, и показали преимущественную их локализацию в головном ганглии. По нашим данным, рецепторы каината участвуют в формировании кратковременной памяти у пчелы.
МЕТИЛИРОВАНИЕ ГИСТОНА H3
455
Изучение характера локализации рецепторов ММЭА-подтипа [7], 1шС1иЯ1 [8], Пш01иЯ [9] иммуногистохимическими методами показало, что они равномерно распределены по головному ганглию пчелы и максимально представлены в зрительных долях и грибовидных телах (центрах интегративной деятельности насекомых).
Роль эндогенных кинуренинов в функционировании высших отделов головного мозга позвоночных [10] и беспозвоночных [11] животных в настоящее время можно считать общепризнанной. Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что способность насекомых (пчела и дрозофила) удерживать в памяти индивидуально приобретенный опыт зависит от содержания кинуренина, кинуреновой кислоты и 3-гидрок-сикинуренина. У человека дефицит кинуреновой кислоты способствует развитию когнитивных расстройств. Многочисленные исследования свидетельствуют также об участии эндогенных кинурениновых метаболитов триптофана в функционировании центральных рецепторов Х-глута-мата у всех представителей животного мира. На модельном объекте — медоносной пчеле — показано, что в условиях дефицита кинуренинов чувствительность членов семейства ионотропных рецепторов (основных сайтов рецепторов ММЭА- и каинатного-подтипов) и 1-Пш01иЯ возрастает на 1—2 порядка. В условиях дефицита кинуреновой кислоты повышается чувствительность глутамат-ных рецепторов у грызунов [12], при этом изменяется и уровень экспрессии компонентов активируемых рецептором сигнальных путей. Это показано нами для компонентов сигнального пути, активируемого ММЭА-рецептором (ЫМК-1, F-actin), и у пчелы [13], и у дрозофилы [14]. У этих насекомых наблюдается снижение в головном ганглии экспрессии ЫМК-1 и существенное повышение (в 1.3—1.5 раза) содержания фибриллярного актина.
Известно, что актиновый цитоскелет вовлечен в синаптогенез, в координацию механизмов сигнальной трансдукции, модификации гистонов, модуляции структуры и функций хроматина, осуществляющего эпигенетическую регуляцию экспрессии генов [15]. В связи с этим, полученные нами данные позволили предположить возможность модуляции эпигенетических механизмов в условиях дефицита кинуренинов. Первые свидетельства об участии эпигенетических механизмов в ассоциативном обучении медоносной пчелы, представлены в работе НаШ§ et а1. [16]. Задача настоящей работы состояла в изучении особенностей метилирования гистона Н3 в нейронах головного ганглия пчелы в условиях дефицита ки-нуренинов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектами исследования служили 10—20-су-точные медоносные пчелы краинской расы (Apis mellifera carnica Polm).
Для создания дефицита кинуренинов пчелам вводили системно (дорсально в торакс) 2 мкл 0.15% раствора аллопуринола (Sigma) — ингибитора триптофан-диоксигеназы. Ранее нами было показано, что фармакологическое воздействие такого рода подавляет долговременную память и вызывает иные поведенческие нарушения, сходные с проявлениями группы мутаций snow, локализованных в структурном гене триптофан-2,3-диоксигеназы. Контролем служили пчелы, которым вводили диметилсульфоксид (DMSO, Sigma). Через 2 ч пчел фиксировали и готовили препараты для иммуногистохимического анализа. Распределение сигнала изучали при помощи световой микроскопии.
Иммуногистохимический метод. Пчел подвергали холодовому наркозу. Вскрывали головную капсулу и выделяли мозг, который фиксировали в 4% параформальдегиде (Sigma) в течение 4 ч. Препараты обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации (40, 70, 96, 100%), выдерживали в метилбензоате (Вектон) в течение ночи, а затем в метилбензоате/парафине (50 : 50, 1 ч). Препараты парафинизировали в течение 3 ч, после чего заливали в парафиновые блоки. Из блоков готовили срезы (7 мкм), которые депарафинизи-ровали, используя ксилол (Вектон) и серию спиртов (100, 96, 70, 40%). Срезы нагревали в цитрат-ном буфере (95°C; соли производства Вектон). Препараты обрабатывали в течение 30 мин 0.3% Н2О2 (Sigma), инкубировали с нормальной блокировочной сывороткой (Vectastain ABC Quick kit, Vector Labs) в течение 2 ч при 25°С. Инкубировали с первичными антителами к метилированному гистону Н3 (rabbit) (Abcam, разведение 1 : 200) в течение ночи при 4°С, затем 1 ч при 37°С с вторичными биотинилированными антителами (Vectastain ABC Quick kit). Инкубировали с АВС-реагентом (Vectastain Elite Peroxidase complex, Vectastain ABC Quick kit) в течение 1 ч при 37° С и окрашивали DAB (диаминобензидин, Vector Labs) в темноте. Окрашенные препараты обезвоживали в спиртах и ксилоле и заключали в безводную среду D-Pex (Sigma). Постоянные препараты анализировали с помощью световой микроскопии и установки, содержащей цифровую CCD-камеру и компьютер с программой Видеотест-FISH. Ден-ситометрию проводили с помощью программы Видеотест-FISH. Полученные данные сравнивали с помощью непараметрического критерия Манна—Уитни. В опытах использовали 12 пчел по шесть в каждой группе (по 10—15 срезов из мозга каждой пчелы).
456
ЗАЧЕПИЛО и др.
Рис. 1. Иммуноокрашивание целого мозга (контроль — инъекции DMSO) на метилирование Lys4 в гистоне H3 (первичные антитела Abcam, вторичные "Vector Labs). Увеличение: 10.
V ' V
• ' ' к
л * ^'/¿-к -1 t
а б
Рис. 2. Иммуноокрашивание каликсов грибовидных тел на метилирование гистона Н3 по 1^4. а — Контроль (ВМ80); б — опыт (аллопуринол). Стрелкой показана область максимального окрашивания (малые клетки Кеньона внутри каликсов грибовидных тел) к метилированному по 1у84 гистону Н3. Увеличение: 10.
Рис. 3. Схема каликсов грибовидных тел. Стрелкой показана область максимального окрашивания к метилированному по 1^4 гистону Н3. а — Контроль (0М80); б — опыт (аллопуринол).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Полученные данные представлены на рис. 1, 2а,б и 3а,б. Как можно видеть из рис. 1, у контрольных особей гистон Н3, метилированный по Ьуъ4, выявляется в зрительных долях, нейронах центрального комплекса и во всех типах клеток Кеньона (указано стрелками). Максимальное количество сигна
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.