научная статья по теме МЕТИЛИРОВАНИЕ ГРУППЫ ГЕНОВ МИКРОРНК ВОВЛЕЧЕНО В РЕГУЛЯЦИЮ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ-МИШЕНЕЙ RAR-BETA2 И NKIRAS1 ПРИ РАКЕ ЛЕГКОГО Биология

Текст научной статьи на тему «МЕТИЛИРОВАНИЕ ГРУППЫ ГЕНОВ МИКРОРНК ВОВЛЕЧЕНО В РЕГУЛЯЦИЮ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ-МИШЕНЕЙ RAR-BETA2 И NKIRAS1 ПРИ РАКЕ ЛЕГКОГО»

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2012, том 46, № 5, с. 773-785

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ^^^^^^^^^^^^^^ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ

УДК 575:599.9

МЕТИЛИРОВАНИЕ ГРУППЫ ГЕНОВ микроРНК ВОВЛЕЧЕНО В РЕГУЛЯЦИЮ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ-МИШЕНЕЙ RAR-beta2 И NKIRAS1 ПРИ РАКЕ ЛЕГКОГО

© 2012 г. Д. С. Ходырев1, И. В. Пронина1, С. В. Рыков1, Е. В. Береснева1, М. В. Фридман1,

Т. П. Казубская2, В. И. Логинов1*, Э. А. Брага1**

Государственный научный центр "ГосНИИгенетика", Москва, 117545 2Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина Российской академии медицинских наук,

Москва, 115478 Поступила в редакцию 20.12.2011 г. Принята к печати 20.02.2012 г.

К настоящему времени известно более 2000 микроРНК человека, каждая из которых может участвовать в регуляции работы сотен белоккодирующих генов-мишеней. На экспрессию генов микроРНК в свою очередь влияет метилирование CpG-островков. Наша цель состояла в оценке роли метилирования в регуляции экспрессии генов микроРНК и, как следствие, в регуляции экспрессии генов-мишеней в первичных опухолях легкого. С использованием единой коллекции образцов немелкоклеточного рака легкого определен статус метилирования и уровень экспрессии группы генов микроРНК и их потенциальных генов-мишеней RAR-beta2 и NKIRAS1, локализованных на хромосоме 3. Выявлено статистически значимое (P < 0.05 по Фишеру) повышение частоты метилирования генов miR-9-1 и miR-34b/c в опухолях легкого по сравнению с гистологически нормальной тканью и маргинально значимое (P < 0.1) — miR-9-3 и miR-193a. Установлена значимая корреляция между изменениями метилирования и уровнем экспрессии гена miR-9-1 (P я 5 х 10-12 по Спирману), что позволяет предположить участие метилирования в регуляции экспрессии этого гена микроРНК в опухолях легкого. Кроме того, обнаружена значимая отрицательная корреляция (P я 3 х 10-12—5 х 10-13 по Спирману) между изменениями уровней экспрессии miR-9-1 и miR-17 и гена-мишени RAR-beta2, и между изменениями уровней экспрессии miR-17и NKIRAS1. Обратная зависимость между уровнями экспрессии генов микроРНК и их генов-мишеней согласуется с известным механизмом подавления экспрессии белоккодирующих генов под действием микроРНК. Впервые определены значимые корреляции (P я 3 х 10-10—4 х 10-13 по Спирману) между изменениями метилирования генов микроРНК (miR-9-1, miR-9-3, miR-34b/c, miR-193a) и экспрессией RAR-beta2, а также между изменениями метилирования генов miR-34b/c и miR-193a и уровнем экспрессии NKIRAS1. Эти результаты указывают на возможность опосредованного влияния метилирования генов ряда микроРНК на изменение экспрессии генов-мишеней.

Ключевые слова: гены микроРНК, мишени микроРНК, гены RAR-beta2 и NKIRAS1, метилирование, метилспецифичная ПЦР, мРНК, при-микроРНК, первичные опухоли легкого.

METHYLATION OF SOME miRNA GENES IS INVOLVED IN THE REGULATION OF THEIR TARGET GENES RAR-beta2 AND NKIRAS1 EXPRESSION IN LUNG CANCER, by D. S. Khodyrev1,I. V. Pronina1, S. V. Rykov1, E. V. Beresneva1, M. V. Freedman1, T. P. Kazubskaya2, V. I. Loginov1*, E. A. Braga1** (1State Research Centre "GosNIIgenetika", Moscow, 117545 Russia; *e-mail: loginov7@genetika.ru, **ebraga@genetika.ru; 2Blokhin Cancer Research Centre, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, 115478 Russia). To date, there are more than two thousand human miRNAs, each of them may be involved in the regulation of hundreds of protein coding target genes. Methylation of CpG-islands, in turn, affects miRNAs gene expression. Our aim was to evaluate the role of methylation in the regulation of miRNA gene expression and, consequently, in the regulation of expression of target genes in primary lung tumors. Using a common collection of non-small cell lung cancer samples we performed a comprehensive study, including analysis of the methylation status and expression levels of some miRNA genes and their potential target genes on chromosome 3: RAR-beta2 and NKIRAS1. Increased frequency of methylation in lung tumors compared to histologically normal tissue was revealed for miR-9-1 and miR-34b/c genes with significant statistics (P < 0.05 by Fisher exact test) and for miR-9-3 and miR-193a was marginally

Принятые сокращения: МС-ПЦР — метилспецифичная полимеразная цепная реакция; НМРЛ — немелкоклеточный рак легкого; ОТ-ПЦР — (здесь) полимеразная цепная реакция на кДНК, полученной с помощью обратной транскрипции РНК; при-микроРНК — первичный предшественник микроРНК; шгЯ — микроРНК (т1КМА).

* Эл. почта: loginov7@genetika.ru, **ebraga@genetika.ru

significant (P < 0.1). Significant correlation was revealed between alterations of methylation and expression level of miR-9-1 gene (P » 5 x 10-12 by Spearman) in the lung tumors, this suggests the role of methylation in the regulation of expression of this miRNA genes. Besides, a statistically significant negative correlation (P » 3 x io-12—5 x 10-13 by Spearman) was found between alterations of expression levels of miR-9-1 and miR-17 and RAR-beta2 target gene and also between expression level alterations of miR-17 and NKIRAS1 that was not previously analyzed. The inverse relationship between expression levels of miRNA genes and their target genes is consistent with the known mechanism of suppression of protein coding genes expression under the action of miRNAs. For the first time significant correlations (P » 3 x io-10—4 x 10-13 by Spearman) were shown between alterations of methylation status of miRNA genes (miR-9-1, miR-9-3, miR-34b/c, miR-193a) and the expression level of RAR-beta2 target gene and between alterations of methylation status of miR-34b/c, and miR-193a and the expression level of NKIRAS1 target gene in the primary lung tumors, which suggests the possibility of indirect effects of methylation of miRNA genes on expression level of target genes.

Keywords: miRNA genes, RAR-beta2 and NKIRAS1 target genes, methylation, methylation-specific PCR, expression level, mRNA, pri-miRNA, primary lung tumors.

Нарушения экспрессии генов при онкогенезе связывают с метилированием ДНК и модификациями гистонов, с транскрипционными и другими белковыми факторами, а также с малыми РНК, в том числе c микроРНК. Обнаружение микроРНК стало революционным открытием в молекулярной биологии. К настоящему времени известно более двух тысяч микроРНК человека (miRBase, http://www.mirbase.org/, Release 18, November 2011), каждая из которых может регулировать работу сотен генов-мишеней [1, 2] (TargetScan (http://www.targetscan.org/, Release 6.0, November 2011). Считается, что экспрессия 30% белоккодирующих генов человека может регулироваться микроРНК [1]. МикроРНК контролируют экспрессию генов на посттранскрипционном уровне, вызывая деградацию мРНК-мишеней или нарушение трансляции [3, 4].

Вовлеченность микроРНК в процесс канцерогенеза позволила создать представление об "он-комирах" (oncomirs), т.е. о тех микроРНК, нарушение экспрессии которых способствует образованию опухолей [5—7]. Крайне плодотворным стало изучение экспрессии генов микроРНК при разных видах рака. Профили экспрессии рассматривают как "микроРНК-паспорта" (signatures miRNAs), так как они оказались высоко специфичными для рака легкого, толстой кишки, почки, яичников, молочной железы и их гистологических типов [8]. Механизмы регуляции экспрессии генов микроРНК остаются малоизученными. Метилирование CpG-островка, прилежащего к гену микроРНК или перекрывающего его, считается одним из путей подавления экспрессии генов микроРНК и затрагивает, как полагают, 10% генов микроРНК [9]. Профили метилирования генов микроРНК также нашли широкое применение в диагностике онкологических заболеваний и прогнозе их течения [10]. Сведения о возможной роли микроРНК в регуляции экспрессии белоккодирующих генов (генов-мишеней) основаны главным образом на биоинформатических

данных, представленных, например, в базах данных TargetScan (http://www.targetscan.org/) и miR2Disease Base (http://www.mir2disease.org/). Экспериментально регуляторные функции микроРНК изучали в основном на линиях опухолевых клеток [11—13].

В представленной работе впервые определен статус метилирования группы генов микроРНК и изменение уровня экспрессии белоккодирующих генов хромосомы 3 RAR-beta2 и NKIRAS1, предполагаемых генов-мишеней этих микроРНК (TargetScan, http://www.targetscan.org/), в первичных опухолях легкого. Наша цель состояла в оценке роли метилирования в регуляции экспрессии генов микроРНК и, как следствие, их генов-мишеней.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Выбор генов микроРНК, связанных с развитием опухолей и перекрывающихся с CpG-островками, а также поиск их генов-мишеней проводили с привлечением следующих баз данных: UCSC Genome Browser (hg 18 (http://genome.ucsc.edu/)), miRBase (http://www.mirbase.org/), MicroRNAdb (http://bioinfo.au.tsinghua.edu.cn/micrornadb/), miRDB (http://mirdb.org/cgi-bin/search.cgi), miRGen (http:// www.diana.pcbi.upenn.edu/miRGen.html), TargetScan (http://www.targetscan.org/), miR2Disease Base (http:// www.mir2disease.org/), miRWalk (http://www.ma.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/), CpGcluster (http:// bioinfo2.ugr.es/CpGcluster/).

Образцы немелкоклеточного рака легкого

(НМРЛ) были получены и клинически охарактеризованы в НИИ КО РОНЦ РАМН. Использовали первичные опухоли легкого только от тех больных, которые до операции не подвергались лучевой или химиотерапии. Все опухоли были классифицированы в соответствии с TNM-клас-сификацией Международного противоракового союза (UICC, версия 2002 г.) и гистологически верифицированы на основании критериев классификации Всемирной Организации Здравоохра-

нения [14, 15]. Для отбора образцов с высоким содержанием опухолевых клеток (не менее 70%) проводили дополнительный гистологический анализ микросрезов (35 мкм), окрашенных эозином и гематоксилином. Образцы тканей хранили при —70°С. Анализировали парные образцы опухолевой и гистологически нормальной ткани от 44 больных НМРЛ. В качестве дополнительного контроля использовали ткани легкого пяти человек без онкологических заболеваний в анамнезе.

Бисульфитную конверсию ДНК и метилспеци-фичную ПЦР (МС-ПЦР) проводили как описано

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком