МИКРОБИОЛОГИЯ, 2013, том 82, № 2, с. 162-168
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 575.224+577.21
МЕТИЛИРОВАНИЕ НОГАЛОЗЫ ПРИ БИОСИНТЕЗЕ НОГАЛАМИЦИНА
У ЗТЯЕРТОИУСЕЗ ШОЛЫТЕЯ 1У65
© 2013 г. Д. А. Климишин*, **, М. В. Рабык*, В. А. Федоренко*, 1
* Львовский национальный университет имени Ивана Франко, Украина **Львовский национальный медицинский университет имени Данила Галицкого, Украина
Поступила в редакцию 18.03.2012 г.
8(гер(отуее$ nogalater ьу65 продуцирует поликетидный антрациклиновый антибиотик ногаламицин, гликозилированный остатками ногалозы и ногаламина. В настоящей работе получены данные биоинформационного анализа генов snogM, snogL и snogY, указывающие, что продукты трансляции этих генов участвуют в метилировании остатка ногалозы антибиотика. В хромосоме £ nogalater ьу65 проведена инсерционная инактивация генов snogM, snogL и snogY, в результате которой получены штаммы £ nogalater Д8по§М, Д8по§Ь и Д8по§У. Инактивация генов О-метилтрансфераз не влияет на антибиотическую активность рекомбинантных штаммов S. nogalater и морфологические характеристики бактерий. Сконструированные штаммы могут использоваться в экспериментах по гетероло-гической экспрессии генов О-метилтрансфераз антрациклиновых антибиотиков.
Ключевые слова: ногаламицин, ногалоза, Streptomyces nogalater, метилирование.
БОТ: 10.7868/80026365613010047
На сегодняшний день изучено широкое разнообразие гликозилированих антибиотически активных соединений, выделенных из различных источников, в том числе, микроорганизмов, растений и некоторых животных [1, 2]. Сахарные остатки большинства антибиотиков принадлежат к семейству 6-дезоксигексоз. В последние годы все большее число генов, участвующих в их биосинтезе, были клонированы и охарактеризованы в геномах различных актиномицетов [2, 3]. Наличие этих сахарных остатков определяет противоопухолевые свойства большинства антибиотиков, играет важную роль в распознавании клеточных мишеней и влияет на фармакокинетику соединений [4]. Поэтому изучение биосинтеза гликозидной части антибиотиков и разработка подходов к конструированию их продуцентов с модифицированными сахарными остатками и новыми сайтами присоединения к агликону, имеют важное теоретическое и практическое значение.
Streptomyces nogalater Lv65 является продуцентом противоопухолевого антибиотика ногалами-цина (рис. 1) [5]. Производные этого антрацикли-нового антибиотика используются в химиотерапии раковых заболеваний. Охарактеризированы отдельные аспекты регуляции продукции ногала-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: v_fedorenko@franko. lviv.ua).
мицина [6—8]. Однако большинство ферментативных реакций биосинтеза антибиотика не изучены. В том числе, неизвестно, каким образом контролируется формирование сахарных остатков антибиотика и их ферментативная модификация, в частности, метилирование [9, 10].
Изучение генов О-метилтрансфераз, модифицирующих сахарный остаток ногалозы ногалами-цина позволит понять последовательность ферментативных реакций в пути биосинтеза антибиотика, а также будет способствовать использованию этих генов в комбинаторном биосинтезе биоло-
H3C
CH3 OH „N,
HO'
H3C
CO2CH3 OH
*CH
OH O OH O CH3O^O XH3 4CH3,
3
CH3O OCH3
Рис. 1. Структура молекулы ногаламицина.
Штаммы и плазмиды, использованные в работе
Штамм, плазмида Характеристика Источник получения
E. coli DH5a F-(<p80dA(lacZ)M15 recAl endAlgyrA96 thil deoR (lacZYA-argF) U169 MBI Fermentas
Е. coli ET12567 (pUB307) dam-13::Tn9(Cmlr) dcm-6 hsdM Коллекция культур микроорганизмов-продуцентов антибиотиков ЛНУ им. Ивана Франко, Украина
£ nogalater Lv 65 (=IMET 43360) Продуцент ногаламицина, дикий тип То же
S. nogalater AsnogM S. nogalater Lv 65 с инсерционной инактивацией гена snogM Создан в работе
S. nogalater AsnogL S. nogalater Lv 65 с инсерционной инактивацией гена snogL То же
S. nogalater AsnogY S. nogalater Lv 65 с инсерционной инактивацией гена snogY То же
pKC1139, 6.5 т.п.н. lacZa onpUC19 oriTRP4 onpSG5 aac(3)IV [13]
pHP45 Q, 4.5 тп.н. pUC19, несущий ген устойчивости к спектино-мицину (QaadA) Ж.Л. Перноде, Политехнический ин-т, г. Орсей, Франция
pKM102, 8.6 т.п.н. pKC1139, несущая фрагмент хромосомы S. nogalater размером 2.1 т.п.н., содержащий ген snogM Создана в работе
pKL102, 8.9 т.п.н. pKC1139, несущая фрагмент хромосомы S. nogalater размером 2.4 т.п.н., содержащий ген snogL То же
pKY102, 8.1 тп.н. pKC1139, несущая фрагмент хромосомы S. nogalater размером 1.6 т.п.н., содержащий ген snogY То же
pKMr.aadA, 10.6 т.п.н. pKM102, в SmaI сайт которой клонирован ген aadA из плазмиды pHP45 Q То же
pKL::aadA, 10.9 т.п.н. рКЬ102, в BamHI сайт которой клонирован ген aadA из плазмиды pHP45 Q То же
pKY::aadA, 10.1 т.п.н. рКУ102 в Sali сайт которой клонирован ген aadA из плазмиды pHP45 Q То же
гически активных соединений. Детальная характеристика генов О-метилтрансфераз, а также белков, которые они кодируют, является предпосылкой дальнейшего получения новых антрацик-линов. Учитывая это, направленный мутагенез генов О-метилтрансфераз является чрезвычайно актуальной задачей.
Целью работы была инсерционная инактивация генов snogM, snogL и snogY, а также биоинформационный анализ продуктов их трансляции. Ожидается, что результаты позволят определить функцию этих генов, а модифицированный по-ликетид может использоваться как субстрат для гетерологической экспрессии других ферментов [11] с целью получения штаммов-продуцентов новых соединений.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИСЛЕДОВАНИЯ
Штаммы и плазмиды, использованные в работе, представлены в таблице. Штамм Streptomyces nogalater Lv65 (=IMET43360) и его производные выращивали на полноценных овсяной (ОС) и соевой (СС) средах, Беннетта [12], минимальных средах Хопвуда и Чапека [13], а также в жидких средах TSB, SG [13] при температуре 28°С, а Escherichia coli ET12567 (pUB307) [11], E. coli DH5a ("MBI Fermentas") и Sarcina lutea — на средах LA и LB при температуре 37°С [13].
Конъюгацию E. coli—S. nogalater осуществляли, как описано ранее [14]. Антибиотик апрами-цин (50 мкг/мл) использовали для селекции трансконъюгантов, а налидиксовую кислоту (100 мкг/мл) — для удаления штамма-донора. В контроле определяли частоту появления спонтанных апрамицин-устойчивых мутантов
S. nogalater. Стабильность наследования плаз-мидных ДНК в клонах трансконъюгантов определяли как отношение числа колоний, сохранивших устойчивость к антибиотику после пяти пассажей в неселективных условиях, к общему числу колоний.
Трансформацию E. coli проводили по стандартной "кальциевой" методике [13].
Антибиотическую активность штаммов S. nogalater изучали методом диффузии в агар с использованием тест-культуры Sarcina lutea. Штаммы S. nogalater выращивали в жидкой среде SG и экстрагировали антибиотик из культураль-ной жидкости хлороформом (1 : 1). Экстракты высушивали при 37°C, сухой остаток растворяли в метаноле, а затем помещали на чашки с 0.7%-ным агаром, который содержал клетки Sarcina lutea (109 КОЕ). Чашки инкубировали при 28°C в течение 12 и 72 ч. Продуктивность штаммов (ИП) оценивали как отношение диаметра зоны угнетения роста S. lutea к сухому мицелию, из которого экстрагирован антибиотик.
Тонкослойную хроматографию (ТСХ) экстрактов антибиотиков проводили на силикагеле-вых пластинках Silufol UV254 в системе растворителей хлороформ : метанол : этанол : дистиллированная вода (120 : 25 : 6 : 4.5). Детекцию антибиотиков на пластинках проводили в видимом и ультрафиолетовом (к 254 нм) свете.
Все молекулярно-биологические процедуры выполняли в соответствии со стандартными протоколами [12]. Нерадиоактивное DIG-мечение ДНК-зондов, ДНК—ДНК гибридизацию, имму-нодетекцию и колориметрическую оценку сигналов гибридизации проводили, используя набор DIG DNA Labeling and Detection Kit ("Boehringer Mannheim", ФРГ) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Отмывку гибридизационных фильтров проводили в жестких условиях. Пары праймеров SnogM1 (5'-TCGTAGGTCACCGGT-GTC-3'), SnogM2 (5'-GCTGCACCGGAAGCT-TAC-3') использовали для амплификации из генома S. nogalater фрагмента, несущего ген snogM.; SnogL1 ( 5' - ATCTGCGGATCCTCGTAG- 3 ') и SnogL2 (5'-GAGCGGGAGAAGGTCTTC-3') - ген snogL, а пару праймеров SnogY1 (5'-TCTGAT-CATGGCCCTGTAG-3') и SnogY2 (5'-TCTGAT-CATGGCCCTGTAG-3') - ген snogY. Полученные ампликоны клонировали в Eco RV-сайт pBluescrip-tlIKS. Затем их перенесли как EcoRI/HindlII-фрагмент в PvuII-сайт pKC1139. В результате получены плазмиды pКМ 102, р^102 и рСТ102. Для конструирования мутантных аллелей генов О-ме-тилтрансфераз в уникальный SmaI-сайт гена snogM плазмиды pKM102, BamHI-сайт snogL и Sa-Л-сайт snogY плазмид рKL102 и рKY102 клонировали ген устойчивости к спектиномицину aadA из плазмиды pHP45fi. Созданные плазмиды, обозна-
ченные как pKM::aadA, рKL::aadA и рKY::aadA, использовали для экспериментов по инсерцион-ной инактивации генов предполагаемых О-мети-лтрансфераз остатка ногалозы в хромосоме S. nogalater.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Мы сравнили вероятные продукты трансляции snogM, snogL и snogY с аминокислотными последовательностями, которые находятся в электронных базах данных GenBank и SwissProt. Как следует из результатов филогенетического анализа метилтрансферазы, гомологи SnogL, формируют две ветви (рис. 2). Одна из них содержит метилтрансферазы S. rishiriensis, S. caeruleus и S. roseo-chromogenes. Вторая содержит SnogL и подобные ему белки. SnogM-подобные белки также формируют две ветви (рис. 3). Одна из них содержит па-ралоги NigE и SCLAV Р0694 S. clavuligerus ATCC 27064. Во второй ветви наблюдается разделение белков на две группы, одна из которых содержит SnogM и метилтрансферазы S. lavendulae NRRL 2564 (паралоги MitM и MitN) и Streptomyces platen-sis subsp. Rosaceus NRRL 18993. Отдельной веткой выделяется метилтрансфераза из S. graminofaciens A-8890. Анализ вероятных аминокислотных последовательностей SnogY и его гомологов (рис. 4) указывает на формирование четко разделенных ветвей паралогов, в частности, для метилтрансферазы S. echinatus (Orf19 и Orf24) и S. steffisbur-gensis NRRL 3193 (StfMII и StfMIII). Белки S. echinatus и S. steffisburgens
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.