ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2007, № 3, с. 290-295
^=МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 550.72:57.082.26:551.312
МЕТОД КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ, ОКИСЛЯЮЩИХ ЖЕЛЕЗО И МАРГАНЕЦ В ДОННЫХ ОТЛОЖЕНИЯХ ОЗЕРА БАЙКАЛ
© 2007 г. Ю. Р. Захарова, В. В. Парфенова
Лимнологический институт СО РАН, 664033 Иркутск, ул. Улан-Баторская, 3, а/я 4199
E-mail: zakharova@lin.irk.ru Поступила в редакцию 12.04.2006 г.
В данной работе представлены результаты апробирования методов культивирования микроорганизмов, окисляющих железо и марганец в донных осадках оз. Байкал. На элективных средах получен рост бактерий с характерным накоплением окислов металлов. Изучены морфология и особенности развития выделенной группы микроорганизмов. Из исследуемой колонки грунта выделено 42 штамма бактерий, окисляющих железо и марганец. Установлено, что культивируемые бактерии приурочены к верхним слоям осадков до глубины 11 см и их численность зависит от типа грунта и окислительно-восстановительных условий.
Железобактерии - микроорганизмы, принимающие участие в окислении и осаждении окислов железа и марганца из растворенных соединений этих элементов. Участие микроорганизмов в окислении железа и марганца косвенно доказывается выделением культур железо- и марганецо-кисляющих бактерий из экосистемы, в которой идет этот процесс (Заварзин, 1972; Дубинина, 1976; Ghiorse, 1984; Emerson, Mayer, 1997). Современные исследования микроорганизмов, окисляющих железо и марганец, основываются на классических трудах С.Н. Виноградского, Н.Г. Холодного, Б.Л. Исаченко, Б.В. Перфильева (Пиневич, 2005). В настоящее время изучению биоразнообразия и физиологии железобактерий уделяется большое внимание многих исследователей (Emerson, Moyer, 1997, 2002; Emerson et al., 1999; Nelson et al., 1999; Brouwers et al., 2000; Straub et al., 2001 и др.). Описания микроорганизмов базируются в основном на морфологических признаках. Часто диагностические признаки (форма и размеры клеток, капсулы чехлов, строение ценобий) некоторых видов железобактерий являются непостоянными. Кроме того, сама способность к окислению железа и марганца проявляется при определенных условиях культивирования.
В настоящее время накоплен достаточно обширный материал, свидетельствующий о широком ареале распространения железобактерий. В том числе они присутствуют в донных осадках оз. Байкал (Горленко и др., 1977).
В воде оз. Байкал железо и марганец практически отсутствуют, тем не менее в донных отложениях в ряде районов постоянно происходит процесс образования железомарганцевых корок, конкреций и прослоек (Гранина, 1991; Гранина и др., 2002) Следует отметить, что озеро характеризуется большой
глубиной, высокой концентрацией кислорода в придонных слоях, низким продуцированием органического вещества и незначительной интенсивностью окислительно-восстановительных процессов в иловых отложениях.
Целью данной работы был подбор условий культивирования на селективных средах для выявления разнообразия микроорганизмов, способных к окислению железа и марганца в донных осадках оз. Байкал.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Образец донного осадка оз. Байкал был отобран бентосной гравитационной трубкой (BGC) в районе ст. "Академический хребет": 53° 41' 49" с.ш. - 108° 21' 12" в.д., глубина 330 м. Длина полученной колонки грунта 63 см. Грунт в колонке исследовали послойно через 1 см. Пробы помещали в стерильные чашки Петри и замораживали. Осадки были представлены диатомовым илом с верхним окисленным слоем до 3 см, был также обнаружен захороненный окисленный слой на глубине 6-12 см, содержащий железомарганце-вые корки (рис. 1).
Сразу после извлечения грунта измеряли рН и Eh при помощи портативных приборов EC/pH-meter WM-22EP (TOA, Япония) и Eh-meter (HORI-BA, Япония), было сделано 31 определение; рН изменялся от 6.8 до 7.2 (в среднем 7.2), Eh - от 511 до 79.
Для выделения колоний микроорганизмов использовали прямой посев на твердые питательные среды как поверхностным, так и глубинным способом; метод предельных разведений и пластинок обрастания. Материал для посева использовали в виде суспензии грунта. Суспензию полу-
чали путем встряхивания пробы грунта на шейке-ре в колбах со стерильной водой в разведении
1 : 100. Для культивирования микроорганизмов, окисляющих железо и марганец, были использованы среды: 1 - лимоннокислое железо 1.0 г, KH2PO4 0.05 г, пептон 5.0 г, агар 15 г, H2O 1 л (Родина, 1965); 2 - пептон 5 г, мясной экстракт 3 г, KNO3 1 г, агар 12 г, лимоннокислое железо 0.1 г, H2O 1 л (Методы ..., 1991); 3 - аммиачное лимоннокислое железо 0.5 г, агар 15 г, H2O 1 л; 4 - NH4Cl 0.1 г, MgCl2 ■ 4H2O 0.05 г, лимоннокислое железо 0.01 г, сенной отвар - 0.2%, MnSO4 ■ 5H2O 0.5 г, агар 12 г, H2O 1 л (Методы ..., 1991); 5 - пептон
2 г, дрожжевой экстракт 0.5 г, MnSO4 ■ 5H2O 0.2 г, FeSO4 ■ 7H2O 0.01 г, агар 15 г, H2O 1 л (Кузнецов, Дубинина, 1989); 6 - Mn(CH3COO)2 0.15 г, агар 15 г, H2O 1 л (Кузнецов, Дубинина, 1989); 7 -(NH4)2SO4 1.5 г, KCl 0.05 г, MgSO4 ■ 7H2O 0.05 г, K2HPO4 0.05 г, Ca(NO3)2 ■ 4H2O 0.01 г, FeS в избытке или железные опилки, H2O 1 л (Родина, 1965); 8 - (NH4)2SO4 1.5 г, KCl 0.05 г, MgSO4 ■ 7H2O 0.05 г, K2HPO4 0.05 г, Ca(NO3)2 ■ 4H2O 0.01 г, Mn(CH3COO)2 0.1 г, агар 15 г, H2O 1 л (Родина, 1965).
Однако высевы на эти среды не дали положительных результатов, так же как и использование пластинок обрастания. Так как получить развитие железо- и марганецокисляющих микроорганизмов при помощи известных методик не удалось, необходимо было их скомбинировать и модифицировать. При этом учитывалось, что все исследованные чистые культуры известных видов железобактерий обладают гетеротрофным типом обмена и окисление закисного железа и марганца не служит для них источником энергии. (Дубинина, 1978; Emerson, Moyer, 1997; Sobolev, Roden, 2001). Исключение составляют облигатно-ацидофильные бактерии. Мы же ориентировались на выделение типичных обитателей пресных водоемов с нейтральной реакцией среды. В результате была использована среда, включающая необходимые компоненты для развития железобактерий: наличие восстановленных форм железа и марганца, органических и минеральных веществ и нейтральные условия среды (Granina, 2003; Belkova, 2004).
Учет численности и выделение чистых культур бактерий, окисляющих марганец и железо, проводили на среде следующего состава: (NH4)SO4 0.5 г, NaNO3 0.5 г, K2HPO4 0.5 г, MgSO4 ■ ■ 7H2O 0.5 г, лимонная кислота 10 г, сахароза 2 г, триптон 1 г, MnSO4 ■ 5H2O 4.7 г, (для марганецокисляющих) или FeSO4 ■ 7H2O 5.9 г, (для железо-окисляющих бактерий), с добавлением агара (15-20 г) или без него, H2O (дистиллированная) 1 л, pH 6.8
Посевы культивировали при температуре 25°С в термостате. Время культивирования составляло от 4-5 сут до 4 нед. Для получения чи-
Глубина, см 0
10 20 30 40 50 60
'////// //
V ////// J // // // // '/////// // // // // "////// // '///////, //////// У // // // / //////// '////// л <///////.
////////
V ////// / // // // // '///////. ////////
////// // '/////// / //////// ' // // // /. //////// ////// /У
'/////// S //////// ////////
У//Ш//А 1
шшшт 2
3
4
5
\ss // // 6
Рис. 1. Строение донных отложений (ст. "Академический хребет", глубина воды 330 м): 1 - Fe-Mn корка коричневого цвета, 2 - серый восстановленный ил, 3 - захороненный окисленный слой, 4 - захороненная Мп корка, 5 - плотная корка черного цвета, 6 - серый восстановленный ил с прослойками гидротроиллита.
стой культуры применяли способ последовательных пересевов.
При изучении морфологии бактерий использовали световую и электронную микроскопию. Препараты для электронной микроскопии готовили по следующей методике: клеточную суспензию фиксировали 2.5%-ным раствором глутаральдеги-да и наносили 20 мкл на поликарбонатный фильтр. Фильтры подсушивали на воздухе, далее проводили обезвоживание спиртом (40%-ным - 15 мин, 50%-ным - 15, 70%-ным - 15, 96%-ным - 10 мин). После обезвоживания снова сушили и сразу же напыляли золотом. Полученные препараты просматривали в сканирующем электронном микроскопе (Philips SEM 525M, Япония).
Препараты для сканирующей электронной микроскопии и химического анализа подготавливали без предварительного обезвоживания, просушивая на воздухе (Tazaki, 1996). Препараты напыляли углеродом и анализировали на сканирующем электронном микроскопе, оснащенном энергетическим спектрометром (SEM: JEOL-JSM-5200LV, EDX: Philips-EDAX PV9800 STD, Япония).
Для трансмиссионной электронной микроскопии клеточную суспензию фиксировали 2.5%-ным глутаральдегидом, центрифугировали (15 мин, 10000 об./мин) и отмывали от среды безбактериальной байкальской водой. Бактериальные клетки без предварительного контрастирования наносили на сеточки для микроскопирования и высушивали на воздухе. Целые бактериальные клетки и минеральные частицы анализировали на трансмиссион-
ном микроскопе (JEOL JEM-2000 ЕХ, Япония) с повышающим напряжением 80 кВ при разном увеличении.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Попытки культивирования железобактерий и выделения чистых культур, как было отмечено выше, остаются неудачными для большинства видов железобактерий. Подобрать оптимальные физико-химические условия для выделения железобактерий очень трудно. Данные микроорганизмы в природе развиваются в неравновесных для ионов Ёе2+ и Мп2+ условиях с конкурирующими процессами химического окисления.
Выделенные на собственной селективной среде бактерии были микроаэрофильными хемоге-теротрофами, использующими в качестве источника углерода органические кислоты и сахара.
Рост и выделение чистых культур. Развитие бактерий на чашках Петри с селективной средой становилось заметным на 4-5-е сут (при 25°С), в некоторых случаях на 10-14-е сут. На поверхности среды появлялись характерные колонии, рост которых сопровождался накоплением желто-оранжевых окислов железа и бурых окислов марганца. По мере роста и развития колоний используемая среда так же меняла цвет, постепенно окисляясь от светло-зеленого до ржавого у желе-зоокисляющих бактерий и от бежевого до коричневого у марганецокисляющих бактерий.
При наблюдении за ростом бактерий были выявлены колонии различного типа, но в дальнейш
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.