^^^^^^^^^^^^ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ
СТАТЬИ
581.1
МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ИССЛЕДОВАНИЮ РЕДОКС-АКТИВНОСТИ АПОПЛАСТА. 1. МЕХАНИЗМЫ ВЫСВОБОЖДЕНИЯ ПЕРОКСИДАЗ © 2014 г. А. В. Часов, Ф. В. Минибаева
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН, Казань
Поступила в редакцию 23.11.2012 г.
В настоящей работе на примере пероксидазы продемонстрирована эффективность использования экстраклеточного раствора (ЭКР), т.е. постинкубационного раствора после извлечения из него корней, для анализа апопластных редокс-ферментов в корнях 5-дневных проростков яровой пшеницы (Тпйеыт аезйуыш Ь., сорт Казанская Юбилейная) после раневого стресса. Подобный неинвазивный подход позволяет исследовать ферменты без разрушения целостности растительной ткани. С помощью ингибиторного анализа показано, что при стрессе из цитоплазмы не высвобождаются вновь синтезированные или уже существующие внутриклеточные пероксидазы. Предлагаемый методический подход к получению ферментативной вытяжки открывает широкие перспективы для фитоим-мунных и стрессологических исследований редокс-ферментов апопласта.
Ключевые слова: Тпйеыт ае5Нуыт — корни пшеницы — пероксидаза — экстраклеточный раствор — апо-пласт
ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2014, том 61, № 4, с. 594-602
УДК
БОТ: 10.7868/80015330314040046
ВВЕДЕНИЕ
Долгое время считалось, что апопласт, включающий в себя межклеточное пространство, клеточную стенку и внешнюю поверхность плазма-леммы, является инертным образованием и функционирует лишь в качестве моста для транспортировки воды и солевых растворов в более "интересный" симпласт. В настоящее время считается общепризнанным, что в качестве резервуара информации о биотическом и абиотическом окружении клетки апопласт вовлечен в генерацию и/или рецепцию стрессовых сигналов и последующий контроль роста и защиты растительных клеток [1]. Изменение факторов внешней среды, абиотической или биотической природы, в первую очередь отражается на состоянии клеточной поверхности. При стрессе на поверхности можно обнаружить высвобождаемые из клеток растворимые вещества, в том числе и ферменты, участвующие в создании системы фитоиммуни-
Сокращения: АД — актиномицин Д; БПИ — буфер постин-фильтрационный; БФА — брефельдин А; Г6ФДГ — глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа; ЦГ — циклогексимид; ЭКР — экстраклеточный раствор.
Адрес для корреспонденции: Часов Андрей Васильевич. 420111 Казань, ул. Лобачевского, 2/31, а/я 30. Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН. Факс: (843) 292-73-47; электронная почта: chasov@mail.knc.ru
тета. Изучение окислительно-восстановительных реакций, происходящих на поверхности клеток, до воздействия и в начальный момент после воздействия стрессора, является важным для понимания запуска адаптивных процессов, приводящих к выживанию или гибели клеток при стрессах.
Для исследования апопластных веществ принято использовать метод вакуумной инфильтрации с последующим центрифугированием, позволяющий экстрагировать из клеток растворимые вещества [2, 3]. Однако этот метод имеет существенный недостаток — может нарушиться нативность тканей растений, что не дает возможности проводить дальнейшие манипуляции с ин-тактным растением или исследовать объект (например, целые органы растений) в динамике в стрессовых условиях. Анализ реакции растения на воздействие какого-либо химического соединения также подразумевает манипуляции с объектом в течение длительного промежутка времени, так как известно, что развитие стресса протекает в несколько стадий. В нашей лаборатории ранее была показана эффективность использования отсеченных от проростков корней пшеницы в качестве тест-системы для исследования реактивности и адаптивных процессов [4]. Использование корней в качестве модельных объектов для тестирования биологической активности хими-
ческих соединений и анализа действия стрессоров внешней среды, по сравнению с другими органами растений, имеет ряд преимуществ [5].
В настоящей статье мы рассматриваем возможные механизмы высвобождения редокс-фер-ментов на примере пероксидазы корней пшеницы в условиях раневого стресса. С этой целью мы использовали ингибиторный метод, воздействуя на корни актиномицином Д (АД), циклогексими-дом (ЦГ) и брефельдином А (БФА) — веществами, ингибирующими транскрипцию [6], трансляцию [7] и секрецию белков [8—10] соответственно. Соль гадолиния ^ё^03)3) была использована в качестве высаливающего и мембранотропного агента [11]. Кроме того, в работе обсуждаются преимущества использования неинвазивных методов для исследования окислительно-восстановительных процессов на клеточной поверхности, происходящих в подверженных стрессовому воздействию корнях растений.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал. Объектом исследования служили отсеченные корни 5-дневных проростков яровой пшеницы (ТгШеыт агзИуыт Ь.) сорта Казанская Юбилейная. Замоченные в водопроводной воде в течение 24 ч семена раскладывали на стекле, покрытом марлей, и проращивали на растворе 0.25 мМ СаС12 в осветительной установке при 25°С, поддерживая режим освещенности 100 Вт/м2 при 12-часовом фотопериоде.
Способы получения ферментативной вытяжки.
1) Экстраклеточный раствор (ЭКР). Немедленно после отсечения от проростков 300 мг корней помещали в стаканчики диаметром 45 мм с 3 мл исследуемого раствора и инкубировали от 5 до 105 мин с умеренным встряхиванием в ЗИакег-357 (Польша). В контрольном варианте корни инкубировали в растворе 0.25 мМ СаС12. Такая методика позволяет избежать анаэробиоза, так как корни равномерно распределяются по дну стаканчика в тонком слое жидкости, при инкубации происходит обмывание корней и они не испытывают недостатка во влаге и воздухе. ЭКР, т.е. постинкубационный раствор после извлечения из него отсеченных корней (содержание белка менее 25 мкг/мл), использовали для анализа активности ферментов.
2) ЭКР с периодической заменой раствора. С целью изучения возможных механизмов появления в ЭКР стресс-индуцированных пероксидаз мы провели эксперименты с отсеченными корнями, которые сначала промывали инкубационным раствором, трижды заменяя его на свежий, а затем инкубировали без замены раствора. Трехкратную замену на свежий раствор проводили с периодами инкубации между заменами раствора
по 5 мин. Показано, что такой трехкратной смены раствора достаточно для снижения активности пероксидазы в 4—5 раз от первоначального уровня, наблюдаемого в первые 5 мин инкубации [12]. Таким образом, периодическая смена инкубационного раствора приводит к вымыванию с клеточной поверхности соединений, слабосвязанных и/или выделяемых клетками во внешнюю среду в начальный период стрессового воздействия. Последующая инкубация без смены раствора в течение 90 мин (общее время эксперимента 105 мин) способствует восстановлению активности пероксидазы практически до первоначального уровня.
Измерения активности пероксидазы, а также содержания К+ в ЭКР проводили после первой смены раствора (5 мин) и через 0, 30, 60 и 90 мин инкубации после последней замены раствора. Для проверки влияния химических соединений их вносили непосредственно в инкубационную среду. В случае кратковременного воздействия этот раствор заменяли на 0.25 мМ СаС12. При необходимости длительного воздействия эффектора применяли предынкубационную обработку интактных корней. При этом корни интактных проростков погружали в опытный раствор и выдерживали без перемешивания в течение требуемого промежутка времени. Все использованные в экспериментах растворы доводили до pH 7 при помощи NaOH или HC1.
3) Буфер постинфильтрационный (БПИ) и апопластная жидкость. Апопластную жидкость получали путем инфильтрации и последующего центрифугирования отсеченных корней. Инфильтрацию проводили по методу [2] с изменениями. Отсеченные корни (10 г) заливали 100 мл 0.1 М Na-цитратного буфера, pH 7, и помещали в колбу Бунзена объемом 250 мл. Инфильтрацию проводили с помощью вакуумного насоса RV 1.5/11 (Чехословакия) при давлении 80 кПа в течение 30 с. Затем из колбы извлекали корни, а БПИ фильтровали через фильтровальную бумагу марки Ф. Корни, обсушенные с помощью фильтровальной бумаги от остатков жидкости, помещали в центрифужные пробирки, имевшие вставки с отверстиями для стекания жидкости. Апопластную жидкость собирали с помощью центрифугирования при 70 g в течение 15 мин при 5°C.
4) Растворимая внутриклеточная фракция. Отсеченные корни (1 г) фиксировали жидким азотом и гомогенизировали в 10 мл 0.1 М Na-цитрат-ном буфере, pH 7. Пробы центрифугировали при 4300 g в течение 15 мин при 5°C и извлекали су-пернатант.
Определение активности ферментов. Активность пероксидазы (КФ 1.11.1.7) в ферментативных вытяжках определяли спектрофотометриче-ски на Lambda 25 ("Perkin Elmer", США), согласно описанному ранее методу, используя в
Таблица 1. Содержание белка, активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) и пероксидазы в ферментативных вытяжках при различных способах их получения из корней 5-дневных проростков (п = 3)
Вариант Белок, мкг/мл Г6ФДГ, образование НАДФ • H, мкмоль/(мин л) Пероксидаза
образование о-диани-зидина окисленного, ммоль/(мин л) удельная активность, 103 ед./мг белка
Экстраклеточный раствор Постинфильтрационный буфер Апопластная жидкость Внутриклеточная растворимая фракция 22 ± 8 56 ± 19 1217 ±96 1186 ± 102 0.9 ± 0.7*** 86.1 ± 14.9 90.9 ± 20.8 0.4 ± 0.2 1.0 ± 0.1*** 157.9 ± 22.7*** 10.5 ± 1.2*** 38.4 ± 21.0 36.8 ± 4.5 259.5 ± 37.3 17.7 ± 2.0
Примечание. Соотношение корни/раствор — 1 г/л. Разница достоверна при Р< 0.001 (***).
качестве субстрата гваякол или о-дианизидин [13]. Цитозольное загрязнение детектировали по активности маркерного цитоплазматического белка глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ, КФ 1.1.1.49) по методу [14, с. 153] с модификациями. Реакционная среда общим объемом 0.6 мл содержала 0.05 М Na-цитратный буфер, pH 7.5, 1 мМ глюкозо-6-фосфат, 1 мМ MgCl2, 0.25 мМ НАДФ и 50 мкл ферментативной вытяжки. Реакцию инициировали внесением НАДФ. Окисление глюкозо-6-фосфата сопровождалось образованием НАДФН, количество которого определяли спектрофотометрически
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.