ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2014, том 61, № 5, с. 668-675
^ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ
СТАТЬИ
УДК 581.1
МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ИССЛЕДОВАНИЮ РЕДОКС-АКТИВНОСТИ АПОПЛАСТА. 2. РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ПЕРОКСИДАЗ © 2014 г. А. В. Часов, Ф. В. Минибаева
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН, Казань
Поступила в редакцию 23.11.2012 г.
Настоящая работа посвящена изучению механизмов субстратной регуляции активности экстраклеточных пероксидаз (ЭКП), а также возможной роли ЭКП при дистанционной передаче стрессового (раневого) сигнала от надземной части проростка (листа) к корням пшеницы (Тпйсыт аезйуыш Ь., сорт Казанская Юбилейная). Наряду с высокой дианизидинпероксидазной активностью экстраклеточный раствор обладал 3,4-дигидрокси-Ь-фенилаланинпероксидазной, аскорбатпероксидаз-ной, аскорбатоксидазной и каталазной активностью. Дианизидиновые пероксидазы были представлены несколькими изоформами и имели широкую субстратную специфичность. Обнаружено, что ЭКП высвобождалась из корней в раствор выращивания, и ее активность в растворе увеличивалась по мере роста корней. Отсечение апикальной части листьев у проростков приводило к всплеску активности ЭКП корней, обнаруживаемой в растворе выращивания. Показано взаимное влияние субстратов ЭКП при окислении в двух- и трехкомпонентных системах. Роль ЭКП в регуляции баланса АФК в апопласте растительных клеток могла быть обусловлена конкурентными и комплементарными взаимоотношениями различных субстратов пероксидаз. Такая субстрат—субстратная регуляция активности пероксидаз может иметь значение для стресс-индуцированного окислительного взрыва в растительных клетках.
Ключевые слова: ТпНсыт ае5Нуыт — проростки — активные формы кислорода — корни пшеницы — пе-роксидаза — экстраклеточный раствор
DOI: 10.7868/S0015330314050042
ВВЕДЕНИЕ
Клеточная поверхность первая испытывает на себе воздействие стрессора. Одним из быстрых (от нескольких секунд до нескольких минут) ответов растений на такое воздействие является окислительный взрыв на поверхности клеток. Исследование редокс-реакций в условиях абиотического и биотического стресса предполагает, что условия эксперимента должны быть приближены к естественным [1]. В связи с этим очевидно, что использование неинвазивных методов для исследования процессов, происходящих на клеточной поверхности, имеет определенные преимущества перед другими методами [2]. В частности, при использовании неинвазивных методов не происходит снижения активности экстраклеточных ферментов и потери их естественных суб-
Сокращения: ДОФА — 3,4-дигадрокси-Ь-фенилаланин; СВИП — среда выращивания интактных проростков; ЭКП — экстраклеточная пероксидаза; ЭКР — экстраклеточный раствор.
Адрес для корреспонденции: Часов Андрей Васильевич. 420111 Казань, ул. Лобачевского, 2/31, а/я 30. Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН. Факс: (843) 292-73-47; e-mail: chasov@mail.knc.ru
стратов и кофакторов, что происходит в результате выделения и очистки белков.
О характере изменения активности экстраклеточных ферментов в динамике корректно судить, проводя манипуляции с одним и тем же объектом (тканью, органом, растением). Ранее мы обнаружили, что раствор после инкубации в нем корней и их последующего удаления (экстраклеточный раствор, ЭКР) обладал высокой редокс-активно-стью [3], изменения которой при стрессе являются частью стрессового ответа растения. Так, активность экстраклеточной пероксидазы (ЭКП) у отсеченных корней пшеницы (при раневом стрессе) оказалась на два порядка выше, чем у интактных корней [4]. Инкубация отсеченных корней в растворах с различными соединениями и субстратами позволяет манипулировать уровнем активности ферментов в ЭКР, исследовать процессы, протекающие на клеточной поверхности, и судить о событиях, происходящих внутри клетки [5, 6]. Кроме того, анализ активности ЭКП ин-тактных корней предоставляет возможность изучения дистанционной передачи стрессового сигнала от надземной части проростка к корням.
Цель работы — охарактеризовать с помощью неинвазивного подхода экстраклеточные редокс-ферменты, в частности, изоферментный состав и субстратную специфичность экстраклеточных пероксидаз корней проростков пшеницы при раневом стрессе.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал. Объектом исследования служили корни проростков яровой пшеницы (ТгШеыт агзИуыт Ь.) сорта Казанская Юбилейная. Замоченные в водопроводной воде в течение 24 ч семена (135 шт./вариант) промывали в дистиллированной воде, раскладывали на стекле, покрытом марлей, смоченной 0.25 мМ СаС12, и выращивали в осветительной установке при 25°С, где поддерживали режим освещенности 100 Вт/м2 при 12-часовом фотопериоде, не допуская подсыхания марли. Система "непрерывного полива" заключалась в обеспечении израсходованной корнями жидкости через марлевый жгут, погруженный одним концом непосредственно в раствор выращивания (144 ± 5.7 мл), а другим концом в сообщающийся сосуд со свежим раствором. При этом семена не омывались раствором; уровень жидкости в системе позволял зерновке соприкасаться с намоченной марлей нижней своей поверхностью, но при этом зародыш находился над поверхностью раствора. К четвертым суткам роста проростков (с момента замачивания) ко-леоптиль лопался, и наружу появлялся первый настоящий лист. Длина самого большого корня у 4- и 5-дневных проростков составляла 44.8 ± 12.1 и 63.7 ± 15.5 мм соответственно.
Определение ферментативной активности проводили в среде выращивания интактных проростков (СВИП), в растворимой внутриклеточной фракции корней и в ЭКР — постинкубационном растворе. Для получения ЭКР 300 мг отсеченных корней инкубировали в 3 мл 0.25 мМ СаС12 в течение 1 ч, после чего корни извлекали. Методы получения растворимой внутриклеточной фракции, определения содержания белка и его электрофо-ретического разделения подробно описаны в нашем предыдущем сообщении [2].
Динамика пероксидазной активности в среде выращивания интактных проростков при передаче стрессового сигнала от листьев к корням. Из среды выращивания 2-дневных проростков (через сутки после переноса семян на раствор 0.25 мМ СаС12) отбирали 250 мкл раствора для анализа активности ЭКП. Отбор проб повторяли через 24 ч в течение 72 ч.
У 4-дневных проростков (после 75 ч выращивания на растворе 0.25 мМ СаС12) отсекали апикальную часть первого настоящего листа (1—2 мм, вариант "стрессированные проростки"), в контрольном варианте проростки не подвергались такому воздействию (вариант "нестрессирован-
ные проростки"). До отсечения, а также через каждые 15 мин после отсечения (в течение первого часа), затем через каждый час (в течение 4 ч) и через сутки после отсечения отбирали по 250 мкл из среды выращивания (СВИП) стрессирован-ных и нестрессированных проростков для определения пероксидазной активности. Через сутки после воздействия (5-дневные проростки) отбирали пробы для определения активности перок-сидазы, аскорбатоксидазы, аскорбатпероксидазы и каталазы в СВИП, растворимой внутриклеточной фракции и ЭКР.
Для электрофоретического разделения изо-форм пероксидазы брали пробы СВИП, ЭКР и растворимой внутриклеточной фракции корней.
Определение активности окислительно-восстановительных ферментов. Активность ферментов определяли спектрофотометрически (Lambda 25, "Perkin Elmer", США). Во всех случаях реакцию инициировали добавлением субстрата к реакционной среде. Активность пероксидазы (КФ 1.11.1.7) и аскорбатпероксидазы (КФ 1.11.1.11) определяли, согласно описанным ранее методам [7].
Об активности аскорбатоксидазы (КФ 1.10.3.3) судили по убыли аскорбиновой кислоты (к = = 265 нм; s = 8.24/(мМ см)). Реакционная среда общим объемом 0.5 мл содержала 0.05 М Na-цит-ратный буфер, pH 7.0, 0.05 мМ аскорбиновую кислоту и 0.15 мл ферментативной вытяжки.
Об активности каталазы (КФ 1.11.1.6) судили по убыли H2O2 (к = 240 нм; s = 40/(мМ см)) в реакционной среде, содержавшей 0.05 М Na-цит-ратный буфер, pH 7.0, 40 мМ H2O2 и 0.15 мл ферментативной вытяжки (общий объем 0.6 мл).
При изучении активности ЭКП при окислении адреналина и 3,4-дигидрокси^-фенилала-нина (ДОФА) исследование проводили на нестрессированных проростках. Реакционная среда общим объемом 0.6 мл содержала 0.25 мМ (в случае двухсубстратной или 0.13 мМ в случае трехсубстрат-ной реакции) Na-цитратный буфер, pH 7.0, 0.1—1.0 мМ основной субстрат, 1.0 мМ H2O2 и 0.36 мл ЭКР. Об активности фермента судили по образованию адренохрома (к = 480 нм; s = = 4020/(М см)) и ДОФАхрома (к = 475 нм; s = = 3.6/(мМ см)) соответственно.
При исследовании влияния на активность ЭКП второго субстрата в реакционную среду к основному субстрату дополнительно вносили 0.001—1.0 мМ соответствующий дополнительный субстрат (аскорбиновую, кофейную, кумаровую, синаповую, сиреневую, феруловую кислоты или сиреневый альдегид). При исследовании влияния трех субстратов к смеси, содержавшей ДОФА и феруловую кислоту, дополнительно вносили аскорбиновую кислоту в соответствующей концентрации. Во всех экспериментах пероксидазную реакцию начинали внесением 1.0 мМ Н2О2.
се Ц
§ И 12
§ s
->10 л ч о
S
я
се S
4 i 2 U ~
5 0
£ °
та ьи
Я Й
О Я
т о
а ч
Л о
иэ ¡^
О *
8 -
4 -
2 -
24 48 72 75
76
77
78
j
79
Время роста, ч
Rf
-4 0.03 -4 0.06 -4 0.10
-4 0.25 -4 0.33 0.37
0.52 0.55
Рис. 1. Активность экстраклеточной пероксидазы корней пшеницы в среде выращивания интактных проростков (СВИП).
Стрелкой на графике обозначен момент отсечения апикальной части первого настоящего листа у проростков. Контроль (нестрессированные проростки) — прямая линия с круглым маркером, стрессированные проростки — пунктирная линия с квадратным маркером. Бары — стандартные отклонения. Здесь, в таблицах и на рисунках разница достоверна при Р< 0.05 (*), <0.01 (**), <0.001 (***).
Использованные реактивы: феруловая, синапо-вая и лимонная кислоты, CaCl2 ("Fluka", Швейцария); ДОФА, о-дианизидин, ^№-метилен-бис-акриламид ("Acros Organics", Бельгия); кофейная и кумаровая кислоты ("Ferak", Германия); акриламид ("Sigma', США); адреналин ("ICN", США); сиреневая кислот
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.