БИОФИЗИКА, 2011, том 56, вып. 6, с. 965-994
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА
УДК 577.3
МЕТОДЫ ДЕТЕКЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ТЕХНОГЕННЫХ НАНОЧАСТИЦ
© 2011 г. О.Д. Гендриксон, И.В. Сафенкова, А.В. Жердев, Б.Б. Дзантиев, В.О. Попов
Институт биох имии им. А .Н. Бах а РАН, 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, стр. 2
E-mail: vpopov@inbi.ras.ru Поступила в p едакцию 09.06.11 г.
П редставлен обзор современных методов детекции и идентификации техногенных наночастиц как в простых, так и в сложных многокомпонентных матриксах для оценки биологического действия и безопасности нанотехнологической продукции. Особое место уделено детекции приоритетных видов биологически активных наночастиц, к которым относятся фуллерены, одно- и многослойные углеродные нанотрубки, наночастицы серебра, золота, оксидов титана, алюминия, церия, цинка и кремния. Охарактеризованы требования, предъявляемые к пробо-подготовке. Представлены результаты успешного применения для детекции техногенных наночастиц в биопробах методов сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии, конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, атомно-силовой микроскопии, сканирующей туннельной микроскопии, эксклюзионной хроматографии, проточного фракционирования в поперечном поле, электрофоретических, светорассеяния, спектрофотометрических, флуорес-центноспектральных, рентгеноспектральных и других спектрометрических, масс-спектрометри-ческих, «счетчиков частиц», иммуно химических. Охарактеризованы возможности и ограничения разных методов, а также их взаимодополняемость.
Ключевые слова: наноматериалы, техногенные наночастицы, нанобиобезопасность, методы детекции.
В настоящее время наблюдается интенсивное развитие нанотехнологий, непрерывный рост объемов производства новых материалов, содержащих наноразмерные техногенные частицы, и расширение областей их применения. Так, по оценке в работе [1], объемы производства наноматериалов в период с 2007 по 2010 годы только в США со ставили до 38000 т/год для наночастиц оксида титана, до 20 т/год -для серебра, до 700 т/год - для оксида церия, более 1000 т/год - для углеродных нанотр убок и до 80 т/год - для фуллеренов. Крупнейшая база данных по наноматериалам «Nanowerk»
[2] содержит сведения о ~3000 наименований коммерческих наночастиц. Непрерывно возрастает количество научных работ по вопросам нанотехнологий и наноматер иалов (поиск в базе данных «Web of Knowledge» выявил за пер иод с 1980 по 2011 годы около 12 тысяч публикаций по ключевому слову «nanotechnology» и более 150 тысяч - по ключевому слову «nanoparticle»).
Результаты ряда исследований, пр оведенных в последние годы, свидетельствуют об особенностях биологического действия наноматериа-лов, отличающих их от традиционных соединений [3-5]. Это открывает широкие возмож-
Сокращения: ТНЧ - техногенные наночастицы; АФК - активные формы кислорода; ТЕМ - просвечивающая электронная микроскопия (transmission electron microscopy); AFM - атомно-силовая микроскопия (atomic force microscopy); EDS - энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия (energy dispersive spectroscopy); EELS - спектр характеристических потерь энергии электронов (electron energy loss spectroscopy); STEM - растровая просвечивающая электронная микроскопия (scanning transmission electron microscopy); ЕSЕM - сканирующая электронная микроскопия в естественной среде (environmental scanning electron microscope); ICP-MS - масс-спектрометрия, индуктивно связанная с плазмой (inductively coupled plasma mass spectroscopy); FFF - метод проточного фракционирования в поперечном поле (field-flow fractionation); LIBD - спектроскопия лазерного разложения (laser-induced breakdown detection); XPS -рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (X-ray photoelectron spectroscopy); XRF - рентгеновская флуоресцентная спектроскопия (X-ray fluorescent spectroscopy); EEM - трехмерная флуоресцентная матричная спектрофотометр ия возбуждения-эмиссии (3D fluorescence excitation-emission matra spectrophotometry); MALDI - ионизация лазерной десорбцией при содействии матрицы (matrix-assisted laser desorption/ionization); SPMS - масс-спектрометрия единичных частиц (single particle mass spectrometry); SMPS - сканирующий мобильность измеритель частиц (scanning mobility particle sizer); ИФА - иммуноферментный анализ; ПО - предел обнаружения.
ности использования наноматериалов в области медицины, фармакологии, производстве про -дуктов питания, при решении экологических и сельскохозяйственных пр облем. Однако высокая биологическая активность техногенных наноча-стиц (ТНЧ) несет в себе потенциальные риски возникновения нежелательных токсических эффектов для работников нанотехнологических предприятий и потребителей продукции наноин-дустрии, контактирующих с нанотехнологически-ми производствами и их отходами [6-9].
К настоящему времени накоплено много информации о токсических эффектах нанома-териалов. Сотни работ по этой проблеме включают исследования на различных живых ор га-низмах - бактериях [10,11], высших растениях [12-14], водных [15,16] и наземных беспозвоночных [17,18], рыбах [19], млекопитающих [2025]. Установлено, что многие ТНЧ легко про -никают через мембраны клеток, обнаруживаются в клеточном ядре, преодолевают гемато-энцефалический барьер, проникают через эпителий и слизистые, распространяются по рес-пир атор ной системе [26-28]. Последствия накопления техногенных наночастиц в нервной ткани, мозге и других жизненно важных органах и клеточных структурах могут быть крайне опасны для здоровья и жизни человека и животных [29]. Потенциальные риски использования наномате-риалов обуславливают необходимость их тщательного изучения, а также разработки способов предотвращения и ликвидации возможных последствий опасного воздействия нанообъектов. В последние годы опубликован ряд обзорных статей, суммирующих данные об оценке рисков использования ТНЧ и их безопасности [6,29-43].
Вопросам нанобиобезопасности на протяжении последних десяти лет уделяется большое внимание в рамках государственных программ США и европейских стран, межгосударственных прогр амм Евр опейского сообщества, ведущих азиатских государств [44]. Несмотря на участие в этих работах тысяч исследователей, проблема нанобиобезопасности далека от решения. Выполняемые проекты направлены на получение знаний по конкретным вопросам (например, по действию наночастиц на те или иные системы органов) и лишь закладывают основы систем контроля рисков, связанных с использованием нанотехнологической продукции, и определения степени потенциальной опасности новых наноматериалов. В этой связи полностью оправданным является проведение активных отечественных исследований в данном направлении, сконцентрированных прежде всего в рамках Федеральной целевой пр ограм-мы «Развитие инфраструктуры наноиндустрии
в Российской Федерации на 2008-2011 гг.». Ра -боты по данной целевой программе включают формирование методической базы, создание методик и средств контроля наночастиц и нано-материалов, их мониторинга на производстве и в потребительской продукции, разработку комплекса методических решений по оценке безопасности нанотехнологической продукции.
Важным элементом в системе оценки нано-биобезопасности являются методы детекции и идентификации наночастиц в биологическом материале. Наличие достоверных данных о накоплении техногенных наночастиц живыми организмами, их преимущественной локализации в органах и тканях, особенностях модификации и трансформации позволит корректно описывать биологическое действие ТНЧ, разрабатывать эффективные методы мониторинга экспозиции и тесты для контроля биологического действия.
Целью настоящего обзора является ср авни-тельная оценка возможностей различных методов обнаружения в биологических объектах приоритетных для мониторинга ТНЧ.
Из рассмотрения исключены наноструктуры природного происхождения либо имеющие биогенные аналоги, хотя их часто относят к на-нотехнологическим объектам. По нашему мнению, для описания отклика живых о рганизмов на биогенные наночастицы существует отлаженный методический аппарат, а эффективное решение актуальных вопросов нанобиобезопас-ности требует, прежде всего, понимания осо-бенностей р еакции на техногенные наночастицы. Не исключено, что в дальнейшем, по мере развития нанотехнологий, понадобится столь же подробная ха рактеристика уникальных осо -бенностей биологического действия специально сконструированных наноструктур на основе биополимеров.
1. К РАТКАЯ ХАРАКТЕРИ СТИКА П РИОРИТЕТНЫ X ВИДОВ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫ X НАНОЧАСТИЦ
1.1. Критерии приоритетности наночастиц.
Решение проблем нанобиобезопасности связано с определением приоритетных характеризуемых ТНЧ [45]. П р и их выборе исходят прежде всего из современного состояния нанотехнологий (приоритетные наночастицы производятся или в ближайшее время будут производиться в больших объемах) и имеющихся данных о факторах риска (приоритетные наночастицы оказывают воздействие на жизненно важные системы организма).
Экспертами Межведомственной программы по корректному упр авлению химическими пр е-паратами (Inter-Organization Programme for the Sound Management of Chemkals, IOMC) и Организации экономической кооперации и развития (Organization for Eœnomk Co-operation and Development, OECD) разр аботан перечень приоритетных наночастиц для характеристики их биологического действия и обеспечения безопасности [46]. В него вошли фуллер ены, одно-и многослойные нанотрубки, наночастицы серебра, железа, оксида титана, оксида алюминия, оксида церия, диоксида кремния, оксида цинка, дендримеры и наноглины. C появлением дополнительных сведений по ТНЧ статус приоритетности может быть изменен. Так, с декабря 2G1G г. из перечня исключены наноча-стицы полистирола и сажи (аморфного углерода), но добавлено коллоидное золото.
Ниже приведены краткие характеристики приоритетных наноматериалов с описанием областей их преимущественного применения и потенциальных угроз для безопасности человека.
l.2. Фуллерены. Фуллерены представляют собой высокостр уктурированные кластеры атомов углерода, образующих три связи друг с другом. Макс
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.