ш
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2014, том 40, № 2, с. 186-195
УДК 579.672861.2
МЕТОДЫ ЭКСПРЕСС-АНАЛИЗА СТАФИЛОКОККОВОГО ЭНТЕРОТОКСИНА А В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ
© 2014 г. И. А. Любавина*, #, Ф. А. Бровко**, Т. И. Валякина*, Ю. В. Вертиев***, Е. В. Гришин*
*ФГБУНИнститут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
117997, Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 **Филиал ФГБУНИнститута биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН ***ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения РФ Поступила в редакцию 11.07.2013 г. Принята к печати 23.09.2013 г.
Разработаны неинструментальные методы обнаружения стафилоккокового энтеротоксина А (SEA) в пробах питьевых молочных продуктов и мясном бульоне с помощью иммунохроматографии (ИХ) и дот-анализа. В качестве детектируемого компонента при проведении ИХ использовали конъюгат моноклональных антител (МА) к SEA с коллоидным золотом (МА-КЗ); при проведении дот-анализа использовали конъюгат МА-КЗ или биотинилированные антитела к SEA и конъюгат стрептави-дин-пероксидаза (STR-HRP). Проведено сравнение результатов анализа SEA разработанными методами и методом иммуноферментного анализа (ИФА). Предел обнаружения составил, нг/мл: 10 (ИХ), 20 (дот-анализ, МА-КЗ), 10 (дот-анализ, STR-HRP), 4 (ИФА). Продолжительность анализа, мин: 25 (ИХ), 60 (дот-анализ, MA-КЗ), 70 (дот-анализ, STR-HRP), 150 (ИФА). Простота и доступность разработанных неинструментальных методов обнаружения позволяют проводить с их помощью единичное и массовое тестирование в условиях недостаточно оборудованных лабораторий, а также во внелабораторных условиях.
Ключевые слова: стафилококковый энтеротоксин А, обнаружение, экспресс-методы, иммунохромато-графия, дот-анализ, моноклональные антитела, коллоидное золото.
DOI: 10.7868/S0132342314020109
ВВЕДЕНИЕ
Стафилококковые энтеротоксины (SEs), продуцируемые штаммами патогенных грамположи-тельных бактерий Staphylococcus aureus, вызывают у человека тяжелые пищевые отравления [1]. Установлено несколько основных серотипов SEs: SEA, SEB, SECn, SED, SEE, SEG, SEH, SEI и т.д. [2, 3]. Наиболее часто пищевую интоксикацию вызывает энтеротоксин серотипа А [4].
Все SEs очень устойчивы к денатурирующим воздействиям окружающей среды [5]. Отравление организма человека может происходить в отсутствие продуцента [6]. Наиболее благоприятной
Сокращения: HRP — пероксидаза хрена; PBS — фосфатно-со-левой буфер, рН 7.4; PBST - PBS с 0.1% Твин-20; SEA, SEB, SED, SEC1, SEE, SEG, SEI — стафилоккоковые энтеротоксины A, B, D, С1, E, G, I; STR — стрептавидин; STR-HRP — конъюгат стрептавидина с пероксидазой, ИХ — иммунохро-матография; ИФА — иммуноферментный анализ; КЗ — коллоидное золото; МА — моноклональные антитела к SEA; МА-КЗ — конъюгат моноклональных антител 6 с коллоидным золотом; MA-Bi — биотинилированные антитела SEA6.
# Автор для связи (эл.почта: ilyubavina@gmail.com).
средой для интенсивного развития стафилокко-ков и секреции токсинов являются молоко и молочные продукты, а также мясо и мясные полуфабрикаты, бульоны и т.д. [7]. Своевременное обнаружение стафилококковых энтеротоксинов, прежде всего энтеротоксина А, — необходимая составляющая контроля за качеством пищевых продуктов [8].
Данные о минимальной отравляющей дозе SEA в пище, вызывающей стафилотоксикоз у человека, в разных источниках значительно различаются. Это различие объясняется как индивидуальной восприимчивостью испытуемых к токсину [9], так и отличием в методиках определения токсикогенного SEA. Так, в исследовании [10], проводившемся на добровольцах, показано, что токсичной для человека является доза 50 нг SEs/кг веса человека (т.е. 3.5 мкг SEs для человека с весом 70 кг). По сведениям, полученным другими авторами, для человека токсичен прием пищи, содержащей SEA в нанограммовых количествах: 100—200 (шоколадное молоко) или 2000 (сыр) [11], 100 (йогурт и другие молочные продукты) [12], 6000 (различные блюда) [13]. В настоящее время в
США Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов как диагностически значимая определена концентрация SEs (в том числе SEA), равная 100 мкг/кг продукта питания [14]. В Российской Федерации, в соответствии с методическими указаниями 4.2.2429-08 "Метод определения стафилококковых энтеротоксинов в пищевых продуктах", утвержденные Главным государственным санитарным врачом РФ 29 октября 2008 г., токсикогенны-ми также считаются продукты, содержание в которых SEs равно или превышает 100 мкг/кг продукта.
До последнего времени для выявления SEs преимущественно использовали метод иммуно-диффузии в геле [14]. Предел обнаружения этим методом составляет 100 нг/мл в пробе, при продолжительности анализа 3 сут. На сегодняшний день для анализа SEs в продуктах питания наибольшее распространение получают иммунохи-мические методы, прежде всего ИФА [15, 16]. Основные характеристики коммерческих иммуно-ферментных тестов для диагностики SEs (формат оценки результата, предел обнаружения и время анализа) составляют: для RIDASCREEN® SET A, B, C, D, E (R-Biopharm AG, Германия) — количественный, 1 нг/мл, 4 ч; для Transia Plate Staphylococcal Enterotoxins Diffchamb AB (Diffchamb, France) — полуколичественный, 1 нг/мл, 2 ч; для Tecra Staphylococcal Enterotoxin visual immunoassay (Bioenterprises Pty Ltd., Австралия) — полуколичественный, 1 нг/мл, 4 ч. Все анализируемые с помощью данных методов пробы продуктов питания требуют предварительной пробоподготовки, в частности, обезжиривания. Тестирование с помощью данных методов могут проводить только квалифицированные сотрудники в специализированных лабораториях.
В то же время для проведения скрининга и мониторинга содержания SEs, прежде всего SEA, в пробах продуктов питания необходимы простые и доступные для применения в малооборудован-ных лабораториях методы с временем анализа менее 1 ч. В настоящее время коммерческих тестов для неинструментальной экспресс-диагностики SEA не существует, хотя наблюдается большой интерес к их созданию [17].
Целью нашего исследования являлась разработка неинструментальных (бесприборных или визуальных) качественных методов анализа SEA, таких как иммунохроматография и дот-анализ в формате гребенки, для проведения диагностики в пробах молочных продуктов и мясного бульона.
В качестве биоспецифических реагентов использовали рекомбинантный энтеротоксин, а также полученные и охарактеризованные ранее моно-клональные антитела к SEA — МА 11 и МА 6 [18], узнающие различные эпитопы молекул природного и рекомбинантного стафилококкового энте-
ротоксина А. Для проведения тестирования выбрали сандвич-формат: на поверхность твердой фазы иммобилизовали антитела МА 11, результат иммунохимического связывания ими энтероток-сина в анализируемой пробе оценивали с помощью конъюгата антител МА 6 с меткой.
Предварительно провели сравнение результатов сандвич-ИФА рекомбинантного и нативного (выделенного из природного штамма (Sigma, США)) SEA, используя антитела МА 6 и МА 11. Чувствительность и специфичность ИФА в анализе рекомбинантного и нативного токсинов полностью совпала, что свидетельствует о высокой степени сродства подобранной пары антител к молекулам природного SEA. Следовательно, можно сделать вывод о том, что антитела МА 6 и МА 11 пригодны для иммунодиагностики нативного SEA.
В качестве детектируемой метки при разработке иммунохроматографического метода тестирования использовали частицы коллоидного золота, а при разработке дот-анализа — как коллоидное золото, так и ферментативную метку — пероксидазу хрена.
Полученные результаты сравнивали с результатами ИФА в сандвич-формате.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Разработка и внедрение диагностических неинструментальных экспресс-тестов, основанных на принципе иммунохимического связывания, одна из основных тенденций в современной аналитической биотехнологии. В настоящее время наибольшее количество диагностикумов для экспресс-анализа разработано в формате иммуно-хроматографии, но востребованными остаются и различные форматы дот-иммуноанализа [17].
В качестве детектируемой метки в большинстве тест-наборов используют неферментативные метки, прежде всего коллоидное золото, с помощью которого можно проводить тестирование в одну стадию, без этапа "визуализации" самого фермента нестабильным и токсичным хромоген-ным субстратом [19].
Метод иммунохроматографии основывается на принципе хроматографического распределении молекул антигена и специфичных антител в двухфазной системе. Тестирование проводят в одну стадию с помощью специальных тестовых полосок, сконструированных из нескольких различных мембран, формирующих впитывающий и поглощающий участки, а также тестовую и зону, рис. 1.1, собранных на клейкую полистироловую основу [20]. На поверхность тестовой зоны сорбируют связующие антитела МА 11, образующие тестовую линию. Выше сорбируют антитела к иммуноглобулинам мыши, образующие контроль-
Поглощающий участок
Тестовая зона
Зона нанесения конъюгата SEA6-K3
Впитывающий участок
I
I
1
2 a
2b
2c
Контрольная линия Тестовая линия
Рис. 1. Вид иммунохроматографической тест-полоски для анализа SEA (1) и иммунохроматографических тест-полосок через 25 мин после начала ИХ теста в пробах PBST, содержащих SEA, нг/мл: 50 (2а); 1 (2b); 20 (2с). Визуальная оценка результатов тестирования: 2а — положительный результат; 2b — отрицательный результат; 2с — результат недостоверен, тест необходимо повторить, используя другую тест-полоску.
ную линию. На верхнюю часть впитывающего участка тест-полоски наносят конъюгат МА-КЗ.
При проведение анализа тест-полоску погружают в пробу впитывающим участком до зоны нанесения конъюгата. Под действие капиллярных сил проба начинает подниматься по тест-полоске и взаимодействует с нанесенным конъюга-том МА-КЗ. Затем реакционная смесь поступает в тестовую зону полоски. В случае если в пробе содержится SEA, происходит его связывание с антителами МА 11. Далее несвязавшиеся компоненты реакционной смеси поступают в поглощающий участок тестовой полоски. При прохожден
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.