ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 1, с. 7-16
УДК 579.2
МЕТОДЫ ИММОБИЛИЗАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ДИНАМИЧЕСКИХ АТОМНО-СИЛОВЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ (ОБЗОР)
© 2014 г. М. С. Куюкина*, **, И. О. Коршунова*, Е. В. Рубцова*, **, И. Б. Ившина*, **
*Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, 614081 **Пермский государственный национальный исследовательский университет, Пермь, 614990
e-mail: kuyukina@iegm.ru Поступила в редакцию 12.08.2013 г.
Атомно-силовая микроскопия (АСМ) — эффективный метод исследования поверхностной ультраструктуры и наномеханических свойств биологических объектов, в том числе живых микроорганизмов. Важным условием АСМ-сканирования в жидкой среде является правильно подобранный метод иммобилизации микроорганизмов, обеспечивающий прочное закрепление клеток на поверхности биологически инертной подложки и сохранение их нативных свойств. В обзоре приведена сравнительная характеристика методов иммобилизации микроорганизмов, применяемых в динамических АСМ-исследованиях. Рассмотрены техники механического удерживания и химического связывания клеток с подложкой, а также белковая и иммуноспецифическая адсорбция.
DOI: 10.7868/S0555109914010085
В настоящее время метод атомно-силовой микроскопии (АCМ), основанной на измерении короткодействующих сил взаимодействия между исследуемой поверхностью образца и микромеханическим зондом (кантилевером) [1, 2], активно применяется в микробиологических исследованиях для описания морфологии микробных клеток, локализации их поверхностных структур [3], изучения наномеханических свойств клеточной стенки [4, 5], выявления характера взаимодействия с другими микроорганизмами и специфическими молекулами [6]. Проведение динамических исследований (в реальном времени) подразумевает длительное прочное удерживание микроорганизмов на поверхности подложки при минимальном воздействии на их жизнеспособность и физиологические свойства. От качества иммобилизации клеток в итоге зависят качество АСМ-изображений и получение воспроизводимых данных об упруго-механических свойствах исследуемых объектов. Следует отметить, что жидкость является средой, моделирующей естественные условия обитания микроорганизмов, и, следовательно, оптимальной для исследования структурной динамики клеток, а также оценки действия различных факторов среды в режиме in situ [6, 7]. Однако эффективность прикрепления микроорганизмов к атомарно-гладкой поверхности подложки недостаточна для сканирования в жидкой среде из-за повышенной жесткости клеток и их малых размеров по сравнению, например, с животными клетками [1, 8]. Кроме того, подвижность и низкая адгезивная активность бактерий создают дополнительные
трудности [2, 9]. Наиболее распространенные проблемы при АСМ-сканировании микроорганизмов — это ненадежное закрепление клеток, их десорбция с поверхности подложки при добавлении жидкой среды и/или смещение клеток иглой кантилевера во время сканирования [1, 3, 7]. В связи с этим необходимы дополнительные методы иммобилизации микроорганизмов, к которым относятся: механическое закрепление на твердых поверхностях, адсорбция на поверхности полимеров, ковалентное связывание, прикрепление с помощью адгезивных белков и лектинов, имму-ноадсорбция.
Известно, что при высушивании на воздухе микробной суспензии, нанесенной на предметное стекло или скол слюды, происходит естественная адсорбция клеток на поверхности подложки. Такой метод пробоподготовки отличается максимальной простотой и позволяет изучать тонкую структуру клеточных поверхностей с высоким пространственным разрешением. Поэтому, несмотря на существенные недостатки, метод АСМ-сканирования на воздухе широко используется в микробиологических исследованиях. Так, с помощью данного метода изучены морфологические характеристики бактерий и микроми-цетов при гипертермическом воздействии [10], взаимодействии с наночастицами металлов [11], антимикробными соединениями [12] и ipt-транс-формации [13]. Кроме того, выявлены различия в ультраструктуре клеток вирулентного штамма Streptococcus mutans дикого типа и мутантов по гену белка WapA, и сделан вывод об участии этого
Рис. 1. Схематическое изображение физико-химических механизмов взаимодействия микробных клеток с поверхностью подложки, лежащих в основе иммобилизации микроорганизмов [7]:
а — механическое удерживание в микролунках литографической решетки; б — электростатическое взаимодействие между отрицательно заряженной клеткой и положительно заряженной подложкой; в — ковалентное связывание с функцианизированной аминогруппами поверхностью; г — ковалентное связывание с функцианизированной карбоксильными группами поверхностью; д — ковалентное связывание с поверхностью, модифицированной глутаральдеги-дом; е — прикрепление с помощью адгезивных полифенольных белков.
(а)
NH2
nh2
(г) NH2
NH2
NH
2
NH NH NH COO CO CO CO COO
(б)
++++++++++
NH
NH2
(д)
NH2 NH2 NH
2
NH
2
NH NH NH I I I
NH2 NH NH NH NH2
(в)
COOH COOH
COOH
COOH
COOH' CO I
COOH
CO 1
CO
I
NH2 NH NH NH NH2
(е)
белка в межклеточных взаимодействиях и формировании биопленок [14]. В недавних работах [15— 18] описаны наномеханические свойства целых клеток, клеточных структур (жгутиков) и биопленок, образуемых грамотрицательными и грампо-ложительными бактериями, в том числе возбудителями опасных инфекционных заболеваний [17]. Однако дегидратация микроорганизмов во время пробоподготовки и в процессе АСМ-сканирования на воздухе приводит к изменениям их размерных параметров и упруго-механических свойств. Поэтому продолжительность сканирования предельно уменьшают, чтобы избежать или снизить эффект дегидратации, либо проводят сканирование в жидкой среде с использованием специальных приемов иммобилизации клеток [1, 4, 19].
Следует отметить, что не существует универсального метода иммобилизации микроорганизмов, в особенности гетерогенных микробных популяций [20]. В таблице приведены основные методы закрепления микробных клеток на подложке, а также преимущества и недостатки различных способов функциализации поверхности подложки, применяемых в динамических АСМ-исследованиях. Оптимальные схемы подготовки образцов для АСМ-сканирования предусматривают минимальное воздействие на клетки, что позволяет получать воспроизводимые результаты [7]. Схематическое изображение физико-химических механизмов взаимодействия микробных клеток с поверхностью подложки представлено на рис. 1.
В обзоре не рассматриваются методы химической фиксации клеток с помощью глутарового альдегида, формальдегида, параформальдегида и пр. [7, 21—25], поскольку их использование ведет к резкому изменению химических и механических свойств клеточных поверхностей и потере жизнеспособности микроорганизмов, что неприемлемо для динамических АСМ-исследований.
Механическая иммобилизация микроорганизмов на твердых поверхностях. Данная группа методов предполагает механическое удерживание микробных клеток на поверхности биологически инертных твердых субстратов. Впервые иммобилизацию микроорганизмов на поликарбонатных мембранных фильтрах использовали при АСМ-сканировании клеток Saccharomyces cerevisiae [26]. Для этого суспензию дрожжей пропускали через мембранный фильтр (диаметр пор 5 мкм) пассивно либо с применением внешнего давления, фильтр закрепляли на столике АСМ и проводили сканирование выступающих из фильтра участков клеток в контактном режиме (рис. 2). В более поздней работе [27] с помощью данного метода исследовали ферментативную эрозию клеточной стенки закрепленных на полимерных фильтрах клеток S. cerevisiae в присутствии проте-азы и амилоглюкозидазы. Преимуществом использования мембранных фильтров является надежное удерживание микроорганизмов в порах фильтра и отсутствие химического воздействия на клетки [1, 3, 5]. Однако данный метод приго-
Основные методы закрепления микробных клеток на подложках, применяемые в динамических АСМ-исследованиях
Подложки, сшивающие агенты Преимущества Недостатки Литература
Механическое закрепление на твердых поверхностях
Мембранные фильтры Простая схема пробоподготовки; отсутствие химического воздействия на клетку. Подходит только для клеток сферической формы; может вызвать деформацию растущих клеток; возможны артефакты (псевдоструктуры) при сканировании. [14, 22, 26-31]
Литографические решетки Простая схема пробоподготовки; возможность индивидуального подбора размерных параметров решетки; отсутствие химического воздействия на клетку; возможность наблюдения за ростом и делением клеток. Может вызвать деформацию растущих клеток. [7, 9]
Адсорбция к поверхности полимеров
Желатин Простая схема пробоподготовки. Вдавливание и деформация клеток; возможна десорбция полимера с подложки, [6, 19, 34, 35]
Агар Подходит для клеток любой формы. загрязнение кантилевера. [56, 57]
Агароза Не оказывает химического воздействия на клетку; не вызывает деформации клеток; возможность сканирования в течение длительного времени и наблюдения за ростом и делением клеток. [39]
Поли^-лизин Простая схема пробоподготовки; подходит для клеток любой формы. Оказывает влияние на морфологию поверхности клеток; может вызвать повышенную секрецию экстраклеточного полимера; непрочное прикрепление клеток к подложке в растворах с высокой ионной силой. [7, 22, 38, 39-45, 47]
Полиэтилени-мин Простая схема пробоподготовки; подходит для клеток любой формы. Возможна десорбция полимера с подложки, загрязнение кантилевера; непрочное прикрепление клеток к подложке в растворах с высокой ионной силой. [21, 4854]
Хитозан и силаны Отсутствие химического воздействия на клетки; подходит для клеток любой формы. Десорбция клеток при сканировании в жидкой среде. [7, 21, 55]
Ковалентная иммобилизация
ЭДК/НГС Подходит для клеток любой формы. Оказывает химическое воздействии на клетки. [7, 59, 60]
Прикрепление с помощью полифенольных белков и лектинов
Полифеноль-ные белки и лектины Простая схема пробоподготовки; подходит для клеток любой формы; не оказывает химического воздействия на клетку; не вызывает деформации клеток. Применение ограничено клетками со специфичным
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.