МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № 5, с. 718-727
= ОБЗОРЫ =
УДК 577.2.616-006
МЕТОДЫ ИММУНОАНАЛИЗА БЕЛКОВ
© 2014 г. Н. А. Лисицын*, А. А. Чёрный, И. Г. Никитина, В. Л. Карпов, С. Ф. Берестень
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва, 119991
Поступила в редакцию 15.04.2014 г. Принята к печати 07.05.2014 г.
В обзоре описаны современные методы иммуноанализа белков: радиоиммуноанализ, иммунофермент-ный анализ, иммуно-ПЦР, электрохимический анализ и метод коиммунопреципитации хроматина, а также основные области их применения.
Ключевые слова: радиоиммуноанализ, иммуноферментный анализ, иммуно-ПЦР, электрохимический анализ, метод коиммунопреципитации хроматина.
METHODS OF PROTEIN IMMUNOANALYSIS, by N. A. Lisitsyn*, A. A. Chernyi, I. G. Nikitina, V. L. Karpov, S. F. Beresten (Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia; *e-mail: niklisitsyn@yahoo.com). This review describes current methods of protein immunoanalysis: radioimmunoanalysis, ELISA, immuno-PCR, electrochemical analysis and chromatin immunoprecipitation, as well as main areas of their application.
Keywords: radioimmunoanalysis, ELISA, immuno-PCR, electrochemical analysis, chromatin immunoprecipitation.
Б01: 10.7868/80026898414050097
Методы иммуноанализа основаны на некова-лентном специфичном связывании антител с антигеном, приводящем к образованию высокопрочных комплексов в присутствии тысяч различных белков в анализируемом образце. Специфичные антитела могут быть получены практически к любому белку или его части, при этом константа диссоциации антител может достигать 10-13 моль/л. Использование методов иммуноанализа в клинической практике позволяет:
1) диагностировать заболевание в группах повышенного риска и прогнозировать его течение;
2) осуществлять мониторинг развития заболевания после операции или терапевтического воздействия; 3) проводить мониторинг присутствия аллергенов, патогенов и токсинов в окружающей среде [1]. Большинство современных иммунологических тестов включают как минимум три основных компонента: 1) детектируемый белок (антиген); 2) антитело и 3) присоединенную к антителу метку, которая детектируется с использованием высокочувствительного химического, биологического или физического метода.
Наиболее часто иммуноанализ осуществляется в несколько этапов (так называемые гетерогенные тесты), реже анализ происходит в одну ста-
* Эл. почта: niklisitsyn@yahoo.com
дию (гомогенные тесты). Первый гомогенный тест, разработанный в 1972 г., был основан на конкуренции морфина, присутствующего в биологическом образце, и добавляемого в образец конъ-югата морфина с ферментом за связывание с антителами к морфину [2]. Структуру конъюгата подбирали таким образом, чтобы при связывании с антителом активность фермента (лизоцима) уменьшалась вследствие пространственного блокирования активного центра фермента (рис. 1). Морфин, содержащийся в анализируемом образце крови или мочи, связывается с антителами. В результате снижается ингибирование лизоцима антителами, т.е. ферментативная активность нелинейно возрастает с повышением концентрации гаптена в образце, что можно выявить спектро-фотометрическими методами. Основанные на том же принципе тесты разработаны для целого ряда гаптенов, главным образом наркотиков и допингов.
Наиболее широко используемые гетерогенные тесты гораздо чувствительнее гомогенных, однако детекция антигена в них происходит в две или три стадии [3]. Перед началом тестирования антитело (с присоединенной меткой) или антиген иммобилизуют на носителе (в лунке плашки, на магнитных шариках и т.п.) в результате адсорбции или ковалентного присоединения. После
Субстрат
Субстрат
В отсутствие гаптена в образце
Антитело
В присутствии гаптена в образце
Продукт Гаптен
Лизоцим
Гаптен
Лизоцим
Антитело
Гаптен
Рис. 1. Схема гомогенного иммунологического теста. В отсутствие гаптена в анализируемом образце активность лизо-цима блокируется антителом (вверху), в присутствии гаптена происходит реактивация фермента вследствие связывания антитела с гаптеном образца (внизу).
взаимодействия антигена образца с меченым антителом неспецифические комплексы разрушают хаотропным агентом (веществом, частично дестабилизирующим трехмерную структуру макромолекул), а затем выявляют метки, присоединенные к антителам, входящим в состав специфичных комплексов. Наиболее часто в качестве таких меток используют:
1. радиоактивные метки (радиоиммуноанализ);
2. люминесцентные метки (метод флуоресцирующих антител и методы, основанные на хеми-люминесценции);
3. ферментные метки (иммуноферментный анализ, ИФА);
4. фрагменты ДНК (иммуно-ПЦР).
За последние полстолетия чувствительность физических и химико-биологических методов
анализа белков удалось повысить в десятки тысяч раз. Как видно из таблицы, в настоящее время наиболее чувствительным методом иммуноанали-за является иммуно-ПЦР, проводимая с использованием липосомных меток. Дополнительно повысить чувствительность тестов можно с использованием предварительной подготовки пробы, что позволяет увеличить концентрацию антигена перед проведением теста. Наиболее эффективные способы такого типа основаны на фишинге [17], а также (в случае анализа биологических жидкостей) на выделении экзосом и микровезикул. При диагностировании онкологических заболеваний аффинная очистка опухолевых экзосом из образцов крови, слюны или мочи больных обеспечивает значительное повышение чувствительности и специфичности иммуноанализа, обусловленное концентрированием опухолевого материала и
удалением большей части посторонних белков. Иммунологические тесты могут проводиться в макро- и микроформате, в частично или полностью автоматизированном режиме. Ниже приведено описание наиболее широко используемых гетерогенных методов иммуноанализа белков.
РАДИОИММУНОАНАЛИЗ (РИА)
Первый метод иммуноанализа был разработан в 1959 г. Berson S.A. и Yalow R.S. [18]. Метод был основан на инкубации образца крови с меченным радиоактивным иодом инсулином и антителами к инсулину. В процессе инкубации эндогенный немеченый инсулин конкурирует с экзогенным радиоактивным инсулином за связывание с антителами. После инкубации проводят разделение свободного инсулина и его комплексов с антителами методом хроматографии на бумаге. Концентрацию инсулина в образце определяли исходя из результатов оценки радиоактивности участков хро-матограммы в сцинтилляционном счетчике [18].
ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ (ИФА)
Иммуноферментный анализ — наиболее часто используемый метод иммуноанализа. Главное отличие ИФА состоит в том, что в качестве присоединяемой к детектирующему или вторичному антителу метки используется фермент, субстрат которого в результате ферментативной реакции приобретает окраску (колорометрический ИФА), способность к флуоресценции (иммунофлуорес-центный анализ) или хемилюминесценции (хе-милюминесцентный анализ). В настоящее время ИФА полностью автоматизирован, а время анализа составляет 30—60 мин. ИФА может проводиться в четырех основных форматах: прямом,
непрямом, сэндвич и конкурентном (рис. 2). Чувствительность сэндвич-ИФА может быть несколько увеличена при использовании гибридной технологии, включающей одновременное использование сэндвич-формата и непрямого формата. Образовавшийся на первом этапе сэндвич-комплекс выявляется с использованием конъюгата фермента со вторичным антителом к детектирующему антителу.
ИФА широко используется для мониторинга функционального состояния различных органов (сердечно-сосудистой системы, надпочечников, поджелудочной железы и т.п.), диагностики воспалений, аллергии и ряда других заболеваний, а также мониторинга лекарственных препаратов, токсинов и наркотических веществ в организме или в окружающей среде. В фундаментальных исследованиях и в клинической практике для проведения ИФА наиболее часто используют три фермента, способных к максимально эффективному превращению субстратов в широком диапазоне температур: пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу кишечника теленка и Р-галактозидазу кишечной палочки.
ИФА может проводиться как в растворе, так и на твердой подложке. В последнем случае наиболее часто используют два формата: 1) вестерн-блотинг, когда анализируемый образец разделяют гель-электрофорезом, а затем переносят белки из геля на мембрану; 2) иммуногистохимический формат, когда взаимодействие антиген-антитело происходит в микросрезе ткани in situ. В обоих случаях субстрат после обработки ферментом переходит из растворимого в нерастворимое состояние.
Недавно был разработан высокочувствительный вариант ИФА, основанный на пересчете единичных молекул белка [19—21]. Метод пересчета
Сравнение пределов детекции раково-эмбрионального антигена (РЭА)*
Метод Чувствительность метода, моль/л Ссылка
Радиоиммуноанализ 10-10 [4]
Хемилюминесцентный анализ 10-11 [5]
Микрочип-анализ » [6]
Метод флуоресцентных антител » [7]
Масс-спектрометрия 10-12 [8]
Амперометрический анализ » [9]
Микрочип-электрофорез » [10]
Колориметрический ИФА » [4]
ИФА единичных молекул 10-13 [11]
Электрохимический анализ » [12]
Рамановская спектроскопия » [13]
Наносенсорный анализ 10-14 [14]
Иммуно-ПЦР 10-14 [15]
Иммунолипосомный ПЦР 10-15 [16]
* Сравниваются методы иммуноанализа, используемые для анализа РЭА (СЕАСАМ5) в образцах сыворотки крови (адаптировано из [16]).
Прямой ИФА
Непрямой ИФА
Субстрат
Конъюгат
Субстрат вторичного антитела с ферментом
г антите
ферме
Фермент
Антитело Антиген Антиген
Сэндвич ИФА
Субстрат
С Конъюгат
детектирующего
Конкурентный ИФА
антитела с ферментом
Первичное антитело
О
Экзогенный
антиген
Поверхность
Захватывающее
антитело Антиген
плашки
Субстрат Субстрат
О
Конъюгат антитела с ферментом
Рис. 2. Схема основных форматов ИФА.
единичных молекул (цифровой анализ), впервые разработанный в группе А.Б. Четверина (Институт белка РАН) для обнаружения молекул ДНК и РНК, назван автором методом гибридизации молекулярных колоний. В отличие от анализа единичных молекул нуклеиновых кислот, где может использоват
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.