МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 3, с. 472-481
= ОБЗОРЫ =
УДК 577.2.08
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БЕЛКОВ С РНК
© 2015 г. В. В. Попова, М. М. Куршакова, Д. В. Копытова*
Институт биологии гена Российской академии наук, Москва 119334 Поступила в редакцию и принята к печати 10.09.2014 г.
РНК-связывающие белки играют важную роль в регуляции экспрессии генов на посттранскрипционном уровне, на этапах сплайсинга пре-мРНК, полиаденилирования, стабилизации и экспорта мРНК из ядра в цитоплазму, локализации мРНК и трансляции. РНК-связывающие белки регулируют эти процессы, прежде всего, путем связывания со специфическими элементами в новосинтезированных или зрелых транскриптах. Многие РНК-связывающие белки распознают определенные нуклеотидные последовательности в РНК, однако для других белков такой информации недостаточно. В частности, РНК-свя-зывающие белки часто конкурируют между собой за связывание с РНК или взаимодействуют с ней кооперативно. Поэтому важно изучать взаимодействия РНК с белком in vivo. Для идентификации нуклео-тидных последовательностей, с которыми взаимодействуют РНК-связывающие белки, разработано множество методов. К ним относятся: анализ изменения электрофоретической подвижности, методы систематического обогащения лигандами, футпринтинга и иммунопреципитации РНК, последовательной сшивки РНК с белком с последующей иммунопреципитацией и множество вариантов этого метода, а также измерение уровня новосинтезированных транскриптов. Все эти методы имеют ряд ограничений, поэтому для выявления нуклеотидной последовательности, с которой связывается белок, необходимо использовать набор дополняющих друг друга подходов.
Ключевые слова: РНК-связывающие белки, РНП-частица, EMSA, SELEX, CLIP, футпринтинг РНК, иммунопреципитация РНК, Run-on-транскрипция.
METHODS OF INVESTIGATION OF RNA-PROTEIN INTERACTIONS, by V. V. Popova, M. M. Kursha-kova, D. V. Kopytova* (Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119334 Russia; *e-mail: d_dmitrieva@mail.ru). RNA-binding proteins play an important role in the regulation of gene expression at post-transcriptional level, at the stages of pre-mRNA splicing, polyadenylation, mRNA stabilization, mRNA export from the nucleus to the cytoplasm, mRNA localization and translation. RBP regulate these processes primarily by binding to specific sequence elements in the newly synthesized or mature transcripts. Although many RNA-binding proteins specifically recognize RNA sequences for other RNA-binding proteins sequence information is not sufficient for binding. In particular, given RBP often compete for binding to target RNA sequence or communicate with it cooperatively. Therefore, it is also essential to investigate the interaction between RNA and RNA-binding proteins of interest in vivo. To identify sequences that interact with RNA-bind-ing proteins many methods have been developed. These methods include: electrophoretic mobility shift assay, systematic evolution of ligands by exponential enrichment, RNA pull-down assay, RNA footprinting, the method of RNA immunoprecipitation, the method of ultraviolet crosslinking and immunoprecipitation and a set of variations of this technique, method for measuring the level of newly synthesized transcripts. Since all of these methods have some limitations it is necessary to use a variety of methods supplementing each other in order to detect the RNA sequence to which the protein binds.
Keywords: RBP, RNP particle, EMSA, SELEX, CLIP, RNA footprinting, RIP-CHIP, Run-on transcription. DOI: 10.7868/S0026898415020111
Для правильной экспрессии генов эукариот необходим экспорт мРНК из клеточного ядра, где осуществляется транскрипция, в цитоплазму, где
происходит синтез белка. В ядре вновь синтезированная мРНК связывается с РНК-связывающими белками и белковыми комплексами, выполняю-
Принятые сокращения: РНП-частица — рибонуклеопротеидная частица; EMSA — анализ изменений электрофоретической подвижности; SELEX — метод систематического обогащения лигандами; RIP — метод иммунопреципитации РНК; CLIP — метод последовательной сшивки РНК с белком и иммунопреципитации; Run-on — метод измерения уровня новосинтезированных транскриптов.
* Эл. почта: d_dmitrieva@mail.ru
щими структурные или экспортные функции, образуя мРНП-частицу. Известно всего несколько белков и белковых комплексов, ответственных за экспорт. Остается неясным, насколько универсальны известные комплексы экспорта, какие транскрипционные комплексы необходимы для формирования и правильного экспорта мРНП-ча-стицы.
В нашей лаборатории в течение продолжительного времени изучаются комплексы формирования и экспорта мРНП-частиц. Нами обнаружен белок ENY2, который входит в состав нескольких комплексов созревания и экспорта мРНК, и новый белковый комплекс, ответственный за экспорт мРНК, названный AMEX [1]. Этот универсальный комплекс найден и у других организмов [2—6]. Показана роль комплекса элонгации транскрипции THO в формировании мРНП-частицы [7]. Обнаружены новые белки дрозофилы, отвечающие за экспорт мРНК [8]. В состав этих комплексов входят белки, отвечающие за связывание комплекса с РНК, а также структурные белки и белки, участвующие в образовании контактов между несколькими комплексами на различных этапах транскрипции.
В настоящее время все больше данных показывают, что правильное формирование и экспорт мРНП-частицы связаны с предыдущими стадиями транскрипции, включая ее активацию и элонгацию, сплайсинг и процессинг З'-конца мРНК. Нарушение различных стадий процесса транскрипции приводит к нарушению формирования мРНП-частицы. Выявление мест посадки РНК-связывающих белков в составе мРНП-частиц необходимо для понимания на каком этапе и посредством какого механизма формируется мРНП-частица и осуществляется ее экспорт из ядра в цитоплазму.
АНАЛИЗ ИЗМЕНЕНИЯ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЙ ПОДВИЖНОСТИ (EMSA)
Анализ изменения электрофоретической подвижности (electrophoretic mobility shift assay — EMSA) часто используется для первичной характеристики взаимодействий РНК с белком. Этот метод дает информацию, необходимую для дальнейших более специфичных экспериментов. Метод EMSA основан на том, что в нативном полиа-криламидном или агарозном геле связанные с белком нуклеиновые кислоты мигрируют более медленно, чем свободные.
EMSA, известный также как анализ торможения в геле (gel retardation assay), представляет собой систему, используемую для обнаружения взаимодействия белков с нуклеиновыми кислотами. Первоначально этот метод был разработан для
количественного измерения взаимодействий между ДНК и белками [9]. С тех пор он развивался в различных направлениях, в том числе, для обнаружения и количественного определения взаимодействий РНК-белок.
Некоторые особенности сделали этот метод одним из самых популярных. К основным преимуществам анализа изменения электрофоретической подвижности перед другими методами можно, по-видимому, отнести: надежность и простоту выполнения, приспособляемость к широкому диапазону условий; чувствительность БМ8Л, в котором для мечения нуклеиновых кислот и последующей радиоавтографии применяют радиоактивные изотопы; очень небольшие концентрации (0.1 нМ или меньше) и небольшие объемы образца (20 мкл и менее) [10]. Кроме того, часто используют нерадиоактивное мечение нуклеиновых кислот, менее чувствительное, однако, выявляемое в дальнейшем как по флуоресценции и хемилюминесцен-ции, так и с помощью иммуногистохимических подходов. Таким образом, большой выбор меток делает БМ8Л универсальным методом. БМ8Л также может использоваться в широком диапазоне размеров и структур нуклеиновых кислот, а также белков различного размера — от небольших олиго-нуклеотидов до тяжелых комплексов транскрипции. При правильно подобранных условиях БМ8Л позволяет произвести разделение белков между несколькими нуклеиновыми кислотами в пределах одного образца [11] или различить комплексы с различной стехиометрией белка и/или распределения сайтов связывания [9]. И, наконец, очень важное свойство этого метода заключается в возможности использования как неочищенных экстрактов, так и очищенных рекомбинантных белков, что позволяет идентифицировать новые белки, взаимодействующие с нуклеиновыми кислотами, а также охарактеризовать специфические белки и их мишени.
Несмотря на свою чувствительность, универсальность и, как правило, легкую выполнимость, БМ8Л имеет ряд ограничений. Во время электрофореза может произойти диссоциация белков и нуклеиновых кислот. Кроме того, БМ8Л не позволяет установить молекулярную массу или размер белков, так как подвижность в геле зависит не только от размера белков, но и от других факторов. БМ8Л не дает непосредственной информации о нуклеотидной последовательности, с которой белки связываются. Эта проблема решается обычно при помощи метода футпринтинга РНК.
Обычный протокол БМ8Л состоит из пяти этапов, которые должны быть оптимизированы для каждого отдельного случая: (1) подготовка образца белка; (2) синтез и мечение нуклеиновой кислоты; (3) реакции связывания; (4) нативный гель-электрофорез и (5) детекция [12].
На протяжении многих лет были разработаны различные варианты протокола EMSA и комбинации EMSA с другими методами. Так в обратном анализе изменения электрофоретической подвижности (rEMSA) мечению подвергается образец белка, а не нуклеиновой кислоты [13]. В методе анализа суперсмещения электрофоретической подвижности (supershift EMSA) используется та же последовательность шагов, что и в обычном EMSA, однако в реакцию добавляют антитела к исследуемому белку. В результате возрастает смещение в геле, поскольку антитела увеличивают молекулярную массу получаемого комплекса. В двумерном анализе изменения электрофоретической подвижности (2D-EMSA) отделение комплексов от несвязанных нуклеиновых кислот в нативном полиакриламидном геле скомбинировано с последующим разделением в денатурирующих условиях. Также в этом методе EMSA комбинируется с методами протеомики и секвени-рования [14—16]. В методе EM SA-трехмерный электрофорез (EMSA-3DE) сформированные комплексы
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.