УСПЕХИ СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ, 2004, том 124, № 3, с. 286-302
УДК: 575.116:577.34
МЕТОДЫ КАРТИРОВАНИЯ ГЕНОМОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
© 2004 г. Э. Р. Рахманалиев, Е. А. Климов, Г. Е. Сулимова
Институт общей генетики им. НИ. Вавилова РАН, Москва
Рассмотрены основные методы картирования геномов млекопитающих, их развитие и методические особенности. Предложена классификация методов картирования на генетические, цитогенети-ческие и физические на основании методических подходов, используемых для построения генетических карт. Детально описан метод картирования с помощью радиационных гибридов соматических клеток (ЯН-картирование) как наиболее эффективный метод картирования крупных геномов.
ВВЕДЕНИЕ
На сегодняшний день не существует четкой классификации методов картирования: одни авторы относят цитогенетические методы (FISH, PRINS и т.п.) к генетическим методам, другие - к физическим. Однако следует помнить, что по сути все методы являются генетическими, так как конечный результат картирования - получение максимально подробной карты взаимного расположения структурных, функциональных и полиморфных последовательностей генома и определение расстояний между ними. Разделение методов картирования на генетические, цитогенетические и физические, предложенное в данной статье, основано исключительно на методических подходах, используемых для построения генетических карт.
Генетическое картирование - это картирование, основанное на методах классической генетики - определении групп сцепления, частоты рекомбинации и построении генетических карт, где единицей измерения служат проценты рекомбинации, или сантиморганы (сМ). Цитогенетичес-кое картирование осуществляется с применением методов цитогенетики, когда для локализации каких-либо нуклеотидных последовательностей и определения их взаимного расположения используются цитологические препараты. И, наконец, физическое картирование - это обширная группа методов, позволяющих строить карты генома (обычно их называют физическими) высокого уровня разрешения и определять расстояния между локализуемыми нуклеотидными последовательностями с точностью от нескольких десятков тысяч п.н. до одной нуклеотидной пары.
В настоящее время выделяют три основных подхода к картированию геномов, различающихся временем появления, необходимой методической базой и спектром возможностей: (функциональный, кандидатный и позиционный) [31, 63] (рис. 1).
Вплоть до последнего времени в картировании доминировал функциональный подход, основанный на априорном наличии некоторой информации о биохимическом полиморфизме, лежащем в основе того или иного наследственного признака. Методически такое картирование начинается с выделения в чистом виде белкового продукта гена. Далее к нему по аминокислотной последовательности подбирают вырожденные праймеры и проводят ПЦР-скрининг геномных библиотек. Однако список генов, для которых эта информация была достаточно полной к настоящему времени практически исчерпан и большинство генов, функция которых была известна, уже клонированы и локализованы.
Близко к функциональному и кандидатное картирование. В этом случае информация о функциональном изменении недостаточно полна, чтобы точно указать ген, однако, могут быть выдвинуты более или менее обоснованные предположения о возможных кандидатах либо по их функции, либо по положению на хромосоме. Важно отметить, что и при функциональном, и при кандидатном подходе клонирование гена, как правило, предшествует его точной локализации в геноме, т.е. картированию. В рамках этих подхо-
Подходы к картированию геномов
X \
Стратегия "прямой генетики" Стратегия "обратной генетики"
Позиция на хромосоме
ф и
функция гена
Функциональное картирование Кандидатное картирование Позиционное картирование
Рис. 1. Стратегические подходы к картированию генома человека.
Функция гена
■Ь
позиция на хромосоме
дов локализовать ген означает пройти путь от его функции к локализации на хромосоме (позиции). Такой путь принято считать выражением стратегии "прямой генетики", он характерен и для традиционных методов генетического и цитогенети-ческого картирования [31]. До недавнего времени он был практически безальтернативным.
Появление в конце 80-х годов множества высокополиморфных ДНК-маркеров дало возможность пойти в обратном направлении - от хромосомной карты к функции. Стратегия "обратной генетики" применительно к поиску генов получила воплощение в позиционном картировании, подразумевающем локализацию гена при отсутствии всякой функциональной информации о нем [60]. При этом место гена на карте устанавливают по результатам анализа его сцепления с ранее локализованными генетическими маркерами и далее детально исследуют уже область генома рядом с маркером.
Основное ограничение позиционного подхода -низкая разрешающая способность генетических карт: интервал между двумя соседними маркерами, в котором локализован ген, может оказаться слишком велик и недоступен физическому картированию.
Для большинства генов, которые были локализованы, характерны структурные аномалии (как правило, это гены, ответственные за наследственные заболевания человека). Это существенно облегчает заключительную стадию поиска гена - его выделение и локализацию.
Способом, который позволяет преодолеть ограничения позиционного картирования, является объединение стратегии "обратной генетики" с преимуществами кандидатного подхода. Такой способ картирования, называемый позиционно-кандидатным, постепенно приходит на смену позиционному. Он заключается в поиске на выявленном участке генома подходящих кандидатных генов [31].
Важным условием успешного позиционного картирования является создание генетических карт высокого разрешения и подробной транскрипционной карты. Такие карты создаются методами физического картирования, которые будут описаны ниже.
Методы картирования геномов млекопитающих разрабатывались и применялись в первую очередь для изучения генома человека. Позже они были использованы для картирования геномов других млекопитающих. Поэтому в данном обзоре большинство методов построения генетических карт будет описано на примере картирования генома человека.
ГЕНЕТИЧЕСКОЕ КАРТИРОВАНИЕ
До недавнего времени изучение геномов как человека, так и других млекопитающих было возможно только путем генетического анализа - построения генетических карт или карт сцепления (linkage map). Генетической картой хромосомы называют относительное положение генов, находящихся в одной группе сцепления [8]. Первым шагом на пути построения генетических карт является формирование групп сцепления генов и исследование их взаимного расположения. Основной метод построения карт сцепления - классический генетический анализ, т.е. анализ наследования признаков в родословной, а также изучение частоты рекомбинации генных локусов в мейозе. Карты сцепления показывают порядок линейного расположения генов и маркеров на хромосоме и генетическое расстояние между ними, выраженное в процентах рекомбинации - сантиморга-нах (сМ). Считается, что два гена на хромосоме находятся на расстоянии 1 сМ, если вероятность рекомбинации между ними в процессе мейоза составляет 1%. Карта генетического сцепления составляет около 2809 сМ для мужчин и 4782 сМ для женщин [72]. Меньший "размер" мужского генома объясняется тем, что частота рекомбинации в сперматогенезе меньше, чем в оогенезе. Средняя длина генома человека в единицах генетического расстояния составляет около 3300 сМ. Сопоставив эту величину с размером гаплоидного генома человека, оцениваемым примерно в 2.91 млрд. п.н. [54, 104], можно заключить, что на 1 сМ генетической карты приходится в среднем немногим менее 1 млн.п.н. ДНК на физической карте генома.
Однако ввиду того, что частота рекомбинации в разных точках генома различна ("горячие точки" рекомбинации, районы генома, где рекомбинация подавлена - центромерные и теломерные участки хромосом, блоки конститутивного гетеро-хроматина и др.), эта величина может существенно варьировать, и в результате карты сцеплений не будут отражать реальных физических расстояний между маркерами и генами на хромосомах.
До начала 70-х годов XX века построение генетических карт человека продвигалось очень медленно. Небольшой размер семей, длительный период одного поколения, ограниченное число информативных родословных и отсутствие методов эффективного цитогенетического анализа всех пар хромосом затрудняло целенаправленное картирование хромосом человека. Так, первый ген человека был локализован на X-хромосоме в 1911 г., а первый аутосомный ген - только в 1968 г. К середине 70-х годов на хромосомах человека было локализовано менее 100 генов, значительная часть которых была локализована в X-хромосоме [2, 6].
Важная роль в прогрессе картирования генома человека принадлежит мутантным генетическим линиям животных (в большинстве случаев это мутантные линии мышей), моделирующим различные наследственные заболевания человека. Хорошо разработаны экспериментальные основы целенаправленного конструирования генетических моделей на базе культивирования эмбриональных стволовых клеток, сайт-специфического разрушения генов или введения в них определенных мутантных аллелей in vitro, отбора клонов с генетическими модификациями и пересадки их в ранние зародыши. В результате подобных манипуляций удается получить линии животных, в частности мышей, с мутациями в определенных генах. В настоящее время разработаны достаточно эффективные подходы для локализации и идентификации генов экспериментальных животных. Высокий процент сходства по нуклеотидным последовательностям между кодирующими областями гомологичных генов млекопитающих и человека, а также большое число консервативных групп сцепления с идентичным расположением генов (так называемых синтенных групп сцепления) позволяет проводить параллельные исследования на модельных объектах, значительно ускоряющие эффективность картирования и молекулярного анализа индивидуальных генов человека.
Дальнейший прогресс в области генетического картирования в значительной мере связан с деятельностью крупных научно-исследовательских центров по соз
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.