научная статья по теме МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДЕНОЗИНТРИФОСФАТА И ДРУГИХ АДЕНИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ Химия

Текст научной статьи на тему «МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДЕНОЗИНТРИФОСФАТА И ДРУГИХ АДЕНИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ»

ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2009, том 64, № 7, с. 677-693

= ОБЗОРЫ

УДК 543.63:577.113.3

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДЕНОЗИНТРИФОСФАТА И ДРУГИХ АДЕНИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ

© 2009 г. С. В. Хлынцева*, Я. Р. Базель*****, А. Б. Вишникин*, В. Андрух**

*Днепропетровский национальный университет 49040 Украина, Днепропетровск, пр. Гагарина, 72 **Университет Павла Йозефа Шафарика в Кошице 04001 Словакия, Кошице, ул. Мойзесова, 11 ***Ужгородский национальный университет 88 000 Украина, Ужгород, ул. Пидгирна, 46 Поступила в редакцию 29.02.2008 г., после доработки 20.10.2008 г.

Рассмотрены опубликованные за последние 25 лет методы определения аденозинтрифосфата: биолюминесцентные с использованием фермента люциферазы светляков (с чувствительностью вплоть до 1014 М); хроматографические (ионообменная, тонкослойная, высокоэффективная жидкостная хроматография) для определения адениновых нуклеотидов в смесях с другими нуклеотидами, нуклео-зидами и азотистыми основаниями, а также флуоресцентные, спектрофотометрические, электрохимические (в том числе с использованием сенсоров), перспективные, но не применяемые широко для определения адениновых нуклеотидов. Показаны их преимущества и недостатки.

Аденозинтрифосфат (АТФ) - естественная составная часть тканей организма человека и животных. Он образуется при реакциях окисления и в процессе гликолитического расщепления углеводов. АТФ является исходным веществом при синтезе нуклеиновых кислот, принимает участие в регуляции многих биохимических процессов, является медиатором в синапсах.

АТФ также участвует в процессах обмена веществ. Взаимодействуя с актомиозином он распадается на аденозиндифосфорную кислоту (АДФ) и неорганический фосфат; при этом высвобождается энергия, значительная часть которой используется мышцами для механической работы, синтеза белка, мочевины и промежуточных продуктов обмена веществ. Таким образом, обеспечение энергией многочисленных биохимических реакций является главной ролью АТФ в организме. АДФ является важным регулятором многих метаболических процессов in vitro, в том числе, окислительного фосфо-рилирования, гликолиза, гликогеогенеза и транспорта ионов [1].

Известно [1, 2], что энергетический уровень клетки зависит от баланса между аденозинфосфа-тами (АТФ, АДФ и АМФ). В качестве фундаментального параметра контроля метаболизма предложен [3] так называемый энергетический заряд (ЭЗ), представляющий собой мольную долю аде-ниновой кислоты, "заряженной" путем превращения ее в АТФ:

ЭЗ =

[ АТФ ] + 1/2[ АДФ ] [АТФ ] + [ АДФ ] + [ АМФ ]'

Указанная величина может изменяться от нуля, когда присутствует только аденозинмонофосфат (АМФ), до 1.0 (что свидетельствует о превращении в АТФ всех молекул АМФ). При этом АДФ рассматривается как "полузаряженная" форма. Отсюда вытекают два важных вывода. Когда ЭЗ превышает 0.5, система использования АТФ повышает свою активность. Когда же ЭЗ снижается до 0.5, в системе доминирует регенерация АТФ. Так, к примеру, установлено, что ЭЗ в клетках растущих бактерий поддерживается на уровне 0.8, в стареющих клетках величина ЭЗ близка к 0.5. При еще меньших значениях ЭЗ клетки теряют активность [2]. Такой подход позволяет использовать АТФ в качестве индикатора жизнеспособности и повреждения клеток.

Кроме того, по содержанию АТФ в объектах окружающей среды можно судить о количестве бактерий, жизнеспособной биомассы и микробиологической активности; поэтому значения концентрации АТФ часто используют для контроля гигиены. Однако, в некоторых случаях определения только АТФ недостаточно, и тогда необходимо определять все адениновые нуклеотиды. Такое одновременное определение АТФ, АДФ и АМФ, в частности, очень важно для контроля качества продуктов, в ходе мониторинга процесса производства и оценки клинической эффективности АТФ-содержащих медикаментов [2, 4 ].

Рис. 1. Структурные формулы Б-люциферина (А) и

оксилюциферина (В).

БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДЕНИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ

Наиболее распространены для определения аде-ниновых нуклеотидов биолюминесцентные методы с использованием фермента люциферазы светляков, преимуществом которых является высокая чувствительность, селективность (при условии использования очищенных ферментов) и относительная простота применения.

Реакция на основе люциферин-люциферазы открыта еще в 1884 г. [5], но детально исследовать люциферазу светляков начали в 1947 г. [6], когда Макелрой, очевидно, первым применил эту реакцию для определения АТФ. Метод базировался на фиксировании времени до исчезновения излучения и даже в условиях визуального контроля процесса позволял определять содержание АТФ в диапазоне 10-150 мкг [7].

Механизм этой реакции в настоящее время исследован довольно детально. В ее основе лежит окисление Б-люциферина (рис.1) в присутствии АТФ и кислорода, катализируемое люциферазой светляков:

АТФ + Б-люциферин + 02 дюцифераза-—- АМФ + оксилюциферин + ПФ + С02 + Н\,

где ПФ - пирофосфат.

Спектр излучения в области 470- 700 нм несимметричен с максимумом при 562 нм. Квантовый выход составляет 0.9 эйнштейн/моль люциферина, а интенсивность излучения пропорциональна концентрации АТФ.

Интересно, что при фракционировании экстрактов светляков сульфатом аммония ферментативная активность терялась, однако легко восстанавливалась при добавлении ионов некоторых металлов. Отмечалось повышение активности в следующем ряду металлов: 7п < N1 < Бе < Со < Мп < Mg [8].

В работах [2, 7] описаны свыше 100 биолюминесцентных методик определения АТФ с использо-

ванием люциферазы светляков, разработанных еще до 1981 г. Предел обнаружения АТФ наиболее чувствительными из них находится на уровне фмоль [9, 10]. Несмотря на это, говорить об уменьшении интереса к методу не приходится - разрабатываются еще более чувствительные методики, применяются новое оборудование, автоматизация, компьютерные технологии.

Благодаря высокой чувствительности, биолюминесцентный метод можно применять и для определения внутриклеточного АТФ [11, 12]. Однако из-за разрушения клеток необходима дополнительная стадия стабилизации их состояния в течение очень малого промежутка времени (секунды или даже миллисекунды). Для этого предложено две методики:

1) быстрый лизис клеток и практически мгновенное определение АТФ;

2) экстракция АТФ (для дезактивации ферментов, которые гидролизуют АТФ) [11].

В последнем случае рекомендуют использовать следующие экстрагенты:

1) буферные растворы (например, трис-борат-ный буфер с рН 9.2) [13, 14];

2) разбавленные растворы кислот (хлорной, три-хлоруксусной) с последующей их нейтрализацией [13, 15-17];

3) поверхностно-активные вещества (например, безалкониум хлорид, Тритон Х-100) [15, 17, 18];

4) органические растворители [17, 19].

Конкретный выбор экстрагента зависит от типа

клеток. Однако все экстрагенты негативно влияют на реакцию АТФ с люциферин-люциферазой, снижая активность люциферазы, что, соответственно, уменьшает чувствительность метода. Авторы [13] предложили использовать для экстракции клеточного АТФ кипящую деионизованную воду, которая практически не влияет на биолюминесценцию, но эффективно ингибирует АТФазу.

В работах [15, 20, 21] для усиления биолюминесцентного излучения предложено использовать ди-этиламиноэтилдекстран, который усиливает биолюминесцентную реакцию в присутствии упоминавшихся Тритона Х-100 и трихлоруксусной кислоты. Авторы [18] предложили использовать для этого ли-посомы, которые содержат фосфатидилхолин и хо-лестерол и способны связывать безалкониум хлорид, образовывая катионные липосомы.

Однако основной проблемой при определении внутриклеточного АТФ является мешающее влияние внешнеклеточного АТФ, ведь концентрация последнего может быть на несколько порядков выше. Для устранения этого влияния были использованы дефосфорилирующие ферменты, такие как апираза [22, 23], АТФаза [22] или же смеси ферментов. К примеру, авторы [24] использовали аденоз-инфосфат-деаминазу и апиразу для преобразования внешнеклеточного АТФ и подобных производных

аденозина в инозин монофосфат (ИМФ). Последний является неактивным в люциферин-люцифе-разной системе.

Другой серьезной проблемой метода является его невысокая селективность относительно многих неорганических ионов, которые мешают определению, существенно уменьшая излучение люциферин-люциферазной системы. Принцип их мешающего влияния состоит в способности соэкстрагироваться с АТФ или же быть частью экстракционной системы (например, при экстракции буферными растворами). Во многих работах [см, например, 25-30] изучено мешающее влияние различных катионов и анионов. Выявлено уменьшение мешающего влияния катионов в следующем ряду:

Cu2+ > Zn2+ > Са2+ > К+ > Na+ > Rb+ > Li+.

Исследования других авторов [28, 30] свидетельствуют о мешающем влиянии и других ионов: Mg2+, Mn2+, Ti3+, Hg2+, Cr3+. Мешающее влияние катионов можно уменьшить с помощью ЭДТА [28].

Подобный ряд для анионов выглядит следующим образом:

2- 3- 2- -

СO2 > РO43 > SO2 > I- ~ NO3 > Br- > Cr- > F- > > СН3СОО-.

Биолюминесцентная реакция проходит очень быстро (20-30 с), начинаясь практически мгновенно после добавления реагентов, когда анализируемый образец и реагенты еще не полностью смешаны. В это время интенсивность излучения может зависеть не только от концентрации АТФ, но и от случайных факторов (например, интенсивности перемешивания). Для повышения чувствительности метода за счет исключения времени перемешивания реагентов из общего времени реакции предложено несколько математических подходов [31, 32]. Среди них методы регрессионного анализа (Robust exponential regression and outliers detection, RER) [31, 32], методы сглаживания (Savitzky-Golay smoothing method (SSG), Kalman Filter smoothing method (SKF)) [31]. Применение этих подходов позволяет существенно уменьшить величину относительного стандартного отклонения, SR (с 0.25 до 0.07) и предел обнаружения ПО (с 6 х 10-9 М до 6.6 х 10-10 М АТФ).

На основании ферментативных превращений создана также амплификационная методика определения АТФ [33] с использованием аденилаткиназы

(АДК) и полифосфаткиназы (ПФК). Основой этого подхода является сл

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком