БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2000, том 26, М 4, с. 243-262
ОБЗОРНАЯ СТАТЬЯ
УДК 577.112.012.6
МЕТОДЫ ПОИСКА АНТИГЕННЫХ ДЕТЕРМИНАНТ ДЛЯ БЕЛКОВ С ИЗВЕСТНОЙ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРОЙ
© 2000 г. Р. П. Евстигнеева, М. Е. Палькеева*#
Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова,
117571, Москва, просп. Вернадского, 86; * Российский кардиологический научно-производственный комплекс МЗ РФ, 121552, Москва, 3-я Черепковская ул., 15а Поступила в редакцию 10.04.98 г. Принята к печати 11.12.99 г.
Рассмотрены теоретические и экспериментальные методы определения антигенных детерминант белков с известной аминокислотной последовательностью. Проведена систематизация методов на основе используемых теоретических подходов. Приводятся данные по сравнительной оценке эффективности различных предсказательных методов, а также примеры нахождения эпитопов экспериментальным путем для ряда белков.
Ключевые слова: белки, аминокислотная последовательность, предсказание антигенной структуры; антигенная детерминанта; эпшпопное картирование; пептидные библиотеки.
СОДЕРЖАНИЕ
Введение.
1. Факторы, влияющие на антигенность белка.
2. Теоретические методы поиска антигенных детерминант белков (предсказание антигенной структуры белка).
2.1. Методы локализации антигенных детерминант, основанные на определении физико-химических свойств полипептидной цепи.
2.2. Статистические методы предсказания вторичной структуры белка.
2.3. Предсказание третичной структуры белка.
2.4. Практическое применение теоретических предсказаний.
2.5. Сравнительная оценка методов предсказания антигенных детерминант.
3. Экспериментальные методы поиска антигенных детерминант.
3.1. Фрагментация комплекса антиген-антитело.
3.2. Генно-инженерные методы.
3.3. Рентгеноструктурный анализ контактных участков антигенного комплекса.
Сокращения: ароС-Н- аполипопротеин С-11; ароЕ - аполи-лопротеин Е; 5норм - температурный фактор; ELISA - метод твердофазного иммуноферментного анализа; ßo-gpl, gp41 и gpC3a - гликопротеины ß2-gp-I, 41 и СЗа; HEV - вирус гепатита Е; HIV - вирус иммунодефицита человека; HTLV - вирус Т-клеточного лейкоза; MAP - мультиплет-ный антигенный пептид; МНС - главный комплекс гисто-совместимости; ORF3 - белок вируса гепатита Е; Р2-С -белок вируса Коксаки; SCR - структурно-консервативный регион.
"Автор для переписки (тел.: (095) 414-67-16; факс: (095) 414-67-86; e-mail: peptide@cardio.ru).
3.4. Использование синтетических пептидов для локализации антигенных детерминант.
Заключение.
ВВЕДЕНИЕ
Понимание биологических функций белков -один из центральных вопросов биохимии. Белки реализуют свои функции через связывание с молекулой-мишенью, образуя с ней комплекс. Образование комплекса может быть временным (фермент - субстрат), может быть необратимым (гаптоглобин - гемоглобин) или же комплекс может проявлять устойчивость, среднюю между двумя этими крайними состояниями.
В любом случае, определение структурных параметров участка белка, ответственного за его связывание с мишенью, необходимо для понимания способа действия молекулы в целом. Разработка подхода к синтетической имитации фрагмента, определяющего биологическую роль белка, открывает массу возможностей для воспроизведения активности этого белка и манипулирования ею. Особенно большое значение такой подход имеет для изучения антигенных свойств белков при решении иммунологических проблем. Успешная замена белка-антигена синтетическим пептидным фрагментом позволяет создать систему диагностики заболевания, способствует эффективной защите от инфекций путем создания вакцины.
Белок является антигеном, если он способен реагировать с антителами или Т-лимфоцитами. Способность белка индуцировать иммунный ответ организма определяет его иммуногенность [1].
Рис. 1. Аминокислотные остатки, образующие эпито-пы в полипептидной цепи миоглобина кашалота [5]. Две конформационные детерминанты, образуемые остатками 34, 53,113 и 83, 144, 145, распознаются разными моноклональными антителами. На основании реакции с пептидными фрагментами был сделан вывод о том, что участок 18-22 - это часть непрерывного эпитопа.
Иммунный ответ организма, вызываемый действием на него антигена, осуществляется при участии иммунокомпетентных клеток - В- и Т-лим-фоцитов. В-Лимфоциты и антител^ (иммуноглобулины) распознают антиген, находящийся в нативном виде в физиологической жидкой среде (гуморальный иммунитет). Специфические участки аминокислотной последовательности белка-антигена, с которыми реагируют антитела, называются В-эпитопами. Т-Лимфоциты распознают такие антигены, которые уже претерпели про-цессинг в клетке и утратили нативную форму. Образующиеся в результате протеолиза пептиды (Т-эпитопы) перемещаются на поверхность анти-генпрезентирующей клетки, связываются с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС) и становятся доступными для восприятия Т-лимфоцитами (клеточный иммунитет).
Для успешной имитации белка-антигена необходимо прежде всего понимание антигенных свойств нашивной молекулы, т.е. локализация в последовательности белка участков, взаимодействующих с иммуноглобулинами и В-лимфоцита-ми. Такие участки были названы антигенными детерминантами, или эпитопами, а те фрагменты гипервариабельной области антитела, которые контактируют с эпитопами, получили название паратопов [2].
Исторически эпитопы были разделены на секвенциальные - отвечающие линейному отрезку полипептидной цепи, и конформационные, включающие в себя аминокислотные остатки, кото-
рые находятся в разных участках полипептидной цепи, но собраны в эпитоп в результате ее упаковки цепи в нативном белке [3]. Атасси подразделил эпитопы на непрерывные и прерывающиеся [4]. На рис. 1 показаны эпитопы разного типа в миоглобине по данным работы [5].
Тот факт, что антитела к белку-антигену способны взаимодействовать также с небольшими линейными пептидами, соответствующими фрагментам его последовательности, подтверждает существование непрерывных эпитопов [6].
Выявление конформационных эпитопов требует рентгеноструктурного исследования комплекса антиген-антитело, что является весьма серьезной задачей, поэтому наибольшее количество информации об антигенной структуре белков основано на сведениях о непрерывных эпитопах. В настоящее время для локализации В-эпитопов предложено значительное количество методов, рассмотрению некоторых из них посвящен данный обзор. Эпитопы, распознаваемые Т-лимфо-цитами (Т-эпитопы), изучены хуже, однако проблема их локализации чрезвычайно важна в свете создания противовирусных вакцин. Вопросы поиска Т-эпитопов в обзоре затронуты лишь частично.
1. ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА АНТИГЕНIIОСТЬ БЕЛКА
Современная иммунология предлагает двойственную модель узнавания антигена антителом [1]. С одной стороны, реакция антигена с антителом происходит благодаря пространственной компле-ментарности их молекул, т.е. топографическому соответствию взаимодействующих участков. Комплементарность предполагает, что антигенная детерминанта должна находиться на поверхности белковой глобулы, иначе говоря, должна быть доступна для антитела.
С другой стороны, при взаимодействии антиген-антитело происходит конформационная перестройка в том участке полипептидной цепи, который охватывает детерминанта, что предполагает его подвижность. Такая укладка полипептидной цепи, которая обеспечивает экспонирование антигенных детерминант, соответствует определенной вторичной и третичной структуре белка.
Сворачивание полипептидной цепи белков, функционирующих в основном в водной среде, происходит таким образом, что гидрофобные остатки плотно контактируют друг с другом и оказываются внутри белковой глобулы, а гидрофильные (полярные) группы попадают на поверхность белка. Иначе говоря, неполярные остатки выдавливают воду из первоначально "рыхлого" клубка полипептидной цепи, что приводит к компактности и стабильности гидрофобного ядра, а экспони-
рование полярных групп на поверхности глобулы облегчает гидратацию белка. Стабильная и биологически активная структура белка поддерживается благодаря кооперативности водородных, ионных, дисульфидных связей, ван-дер-ваальсовых сил и гидрофобных взаимодействий [7].
Рассмотренные выше факторы, влияющие на антигенность белка, положены в основу различных методов локализации эпитопов. Условно методы разделены на теоретические и экспериментальные (полуэмпирические).
2. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ПОИСКА АНТИГЕННЫХ ДЕТЕРМИНАНТ БЕЛКОВ (ПРЕДСКАЗАНИЕ АНТИГЕННОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКА)
Как уже упоминалось, антигенная детерминанта должна находиться на поверхности белка. Однако выявить поверхностно-локализованные участки возможно только при рентгеноструктурном анализе кристаллов белков, что является особой проблемой. В этой связи широкое распространение получили методы теоретического предсказания антигенных детерминант, использующие только сведения о первичной структуре белков.
Развитие теоретических методов локализации эпитопов стало возможным благодаря прогрессу техники секвенирования ДНК и белков.
В основе теоретических предсказаний лежит установление определенных физико-химических и статистических характеристик участков полипептидной цепи и выяснение корреляции этих характеристик с антигенностью. Такие свойства, как поверхностная доступность, гидрофильность, сегментная подвижность, конформационные статистические параметры, рассчитываются с помощью компьютерных программ для каждого аминокислотного остатка и представляются в виде шкал (профилей), по экстремумам которых выбираются предполагаемые антигенные детерминанты.
Любое теоретическое предсказание начинается с обращения к банкам данных, содержащим сведения об известных белках, таким, как "Atlas of Protein Sequence and Structure" Дэйхофа [8], "Brookhaven Protein Data Bank" [9], "SWISS-PROT" [10] и др. Объем банков данных неуклонно расширяется; в настоящее время число известных аминокислотных последовательностей превышает 100000 [10], однако количество белков с расшифрованной трехмерной структурой составляет всего 15000 [I I]. Ниже описаны различные подходы к теоретическому предсказанию ант
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.