БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 3, с. 163 - 178
ОБЗОРНАЯ СТАТЬЯ
УДК 547.46611*2:542.95
МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕЙТЕРИРОВАННЫХ АМИНОКИСЛОТ
© 1995 г. А. Б. Пшеничникова*, Е. Н. Карнаухова, Е. Н. Звонкова, В. И. Швец
Московская академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, 117571, Москва, пр. Вернадского, 86 Поступила в редакцию 11.06.93 г. После доработки 21.10.94 г.
Рассмотрены современное состояние и перспективы использования аминокислот, меченных стабильными изотопами. Систематизированы способы получения дейтериймеченых аминокислот -синтетические, химико-ферментативные, биосинтетические, а также реакции изотопного замещения водорода. Обсуждаются проблемы получения оптически чистых аминокислот.
Ключевые слова: аминокислоты дейтериймеченые, изотопный обмен водорода, химический синтез, ферментативное получение, биосинтез.
Методы получения и перспективы
использования аминокислот, меченных стабильными изотопами
Последние годы аминокислоты, меченные стабильными изотопами - 2Н, 13С, и 180, - привлекают всевозрастающее внимание исследователей. Тенденции к предпочтительному применению стабильных изотопов по сравнению с радиоактивными обусловлены главным образом такими их преимуществами, как отсутствие радиационной опасности и возможность определения локализации метки в молекуле прямыми методами.
Поскольку изоморфное изотопное замещение одного или нескольких атомов в молекуле практически не сказывается на ее стерических свойствах и электронном состоянии, наиболее подходящим и перспективным современным подходом к изучению структуры и функций биологически активных веществ, а также биологических систем на молекулярном уровне представляется исследование меченых структур с помощью изотоп-но-чувствительной техники, не изменяющей на-тивное состояние молекул.
Использование аминокислот и других биологически активных соединений, меченных стабильными изотопами, в значительной мере ограничивается малой доступностью и дороговизной самих высокоочищенных изотопов, выделяемых из природных источников. Природная распространенность стабильных изотопов варьирует от 0.015% (относительно общего количества элемента) для дейтерия до 1.11% для 13С. Однако, несмотря на низкое содержание изотопов, разработанные в последние годы методы очистки позво-
* Автор для переписки.
ляют получать низкомолекулярные меченые вещества высокой изотопной чистоты.
Развитие изотопно-чувствительной техники, прежде всего ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и масс-спектрометрии, способствовало более интенсивному использованию стабильно меченных веществ в биологических исследованиях разнообразного характера [1 - 3].
Весьма перспективным методом детекции соединений, меченных стабильными изотопами, является ИК-спектроскопия Фурье, которая была успешно применена для определения содержания 13С в клинических анализах образцов газообразных продуктов метаболизма [2, 4]. Интенсивное развитие техники и методологии ЯМР за последние годы сделало возможным исследование метаболизма веществ in vivo, а также способствовало изучению структур и механизмов действия биологически активных соединений. Особую ценность в этом аспекте представляют исследования пространственной структуры белка. В отличие от рентгеноструктурного анализа, для которого требуются ощутимые количества веществ в виде кристаллов [5, 6], что возможно не для всех белков, ЯМР в его различных вариантах может дать структурную информацию о веществах в растворе [7] или других некристаллических формах (см., например, [8,9] о ЯМР "твердого" состояния).
С помощью техники многомерной ЯМР-спект-роскопии [10] успешно определяется пространственная структура сравнительно маленьких белков с молекулярной массой около 10 кДа [11, 12]. Для белков с большей молекулярной массой интерпретация спектральных данных ЯМР усложняется значительным перекрыванием сигналов. В связи с этим целесообразно обогащение молекул
белка стабильными изотопами. Так, включение 13С [13] упрощает отнесение сигналов соседних углеродных атомов. Спектры 'Н-ЯМР крупных белков значительно упрощаются для интерпретации, если атомы водорода замещены на дейтерий. Равномерное замещение атомов водорода на дейтерий (так же как и включение изотопов углерода и 15N) может быть достигнуто биосинтетическим путем за счет культивирования соответствующих микроорганизмов на средах, содержащих низкомолекулярные меченые субстраты [14, 15]. Метод может быть распространен и на крупные белковые молекулы с молекулярной массой вплоть до 40 кДа [16, 17].
Использование аминокислот, меченных стабильными изотопами, подходящего варианта ЯМР и соответствующего алгоритма структурных расчетов позволяет получать уникальную информацию о структуре молекул, а также более сложных молекулярных комплексов [18-21].
Ключевым моментом в исследованиях биологически активных соединений, меченных стабильными изотопами, является, безусловно, разработка методов их получения. В настоящее время не существует какого-либо универсального подхода для получения аминокислот, меченных стабильными изотопами (2Н, 13С, 15N или 180). Хорошо разработанные способы синтеза радиоактивно меченных соединений не всегда приемлемы для этих целей. В то же время существует набор разнообразных, уже апробированных методов, которые позволяют вводить требуемую метку по одному или нескольким положениям молекулы соединения в зависимости от цели его исследования.
Обобщив обширный литературный материал по получению и использованию аминокислот, меченных разными стабильными изотопами, авторы считают целесообразным рассмотреть методы получения дейтерированных аминокислот отдельно, тем более что эта область слабо освещена в отечественных и зарубежных обзорах.
Современное состояние и перспективы структурных исследований дейтерированных белков с помощью 'Н-ЯМР рассмотрены подробно Д. ЛеМастером [22 - 24]. Описанный в литературе последних лет биосинтез дейтерированных белков позволяет достигать изотопного обогащения путем
- экспрессии соответствующего гена в составе вектора в клетках (например, в Escherichia coli), выращенных на 2Н20-содержащих средах; так были получены образцы тиоредоксина с 50 и 75%-ным обогащением дейтерием [23, 25];
- равномерного включения метки в состав питательной среды - метода, давно уже разработанного в экспериментах с одноклеточными водорослями и метилотрофными микроорганизмами;
- использования комплексных питательных сред с мечеными аминокислотами или их предшественниками для культивирования гетеротрофных микроорганизмов (см., например, [20]).
По сравнению с соединениями, содержащими ПС и 15N, использование дейтерированных веществ в клинических исследованиях, а также получение последних микробиологическим путем может быть несколько ограничено ввиду значительного изотопного эффекта дейтерия [26, 27]. Кроме того, дейтериевая метка может быть потеряна за счет обратного изотопного обмена, легко протекающего по некоторым положениям молекулы аминокислоты иногда даже в водных растворах, а также и в результате ферментативного расщепления молекулы.
Настоящий обзор методов получения дейте-риймеченых аминокислот состоит из четырех основных разделов. В первом разделе рассмотрены реакции 'Н-2Н-обмена в самих аминокислотах или их производных, приводящие к дейтерированным аналогам. Во втором систематизированы синтетические методы введения метки. В третьем и четвертом разделах рассмотрены наиболее интересные примеры химико-ферментативного и биосинтетического образования дейтерированных препаратов.
Получение дейтериймеченых а-аминокислот методом 'Н-2Н-обмена
Изотопный обмен водорода - наиболее простой и удобный метод получения дейтериймеченых оптически чистых аминокислот, однако его эффективность определяется возможностью проведения 'Н-2Н-обмена в мягких условиях, исключающих рацемизацию. Наиболее широко этот метод применяется для получения меченных дейтерием ароматических аминокислот - фенил-аланина, тирозина, триптофана и гистидина. Хорошо известно, что первые три аминокислоты обменивают ароматические протоны на дейтерий по механизму электрофильного замещения в растворах минеральных дейтерокислот в достаточно мягких условиях. Этим методом могут быть получены почти количественно ¿-[2Н5]фенилала-нин в 85% дейтеросерной кислоте при 50°С [28], ¿-[3',5'-2Н2]тирозин в 6 н. 2H2S04 или 2 н. 2НС1 при температуре кипения раствора [28 - 30] и ¿-[2Н5]триптофан в 75 - 100% дейтеротрифторук-сусной кислоте [28,29, 31] или в 2 н. 2НС1 при 50°С [32]. В молекуле гистидина легко обменивается протон при С2 имидазольного кольца в нейтральной 2Н20 [28, 33] по механизму, включающему атаку нуклеофила на положительно заряженный или нейтральный имидазольный цикл и последующее его взаимодействие с молекулой 2Н20 [33, 34]. Проведение изотопного обмена в более жестких
условиях, позволяющих дополнительно ввести 2Н в положения 2', 6' молекулы тирозина (8 н. 2H2S04, 180°С [35]) или в положение 5' молекулы гистиди-на (2НС1/2Н20, р2Н 5.0, 180°С [36] или кипячение в [2Н]трифторуксусной кислоте [37]), сопровождается рацемизацией, а следовательно, изотопным обменом водорода при С2, т.е. образуются соответственно £)^-[2,2',3',5',6'-2Н5]тирозин и £)/,-[2,2',5'-2Н3]гистидин. Обратный 2Н-'Н-обмен в этих аминокислотах в мягких условиях позволяет получить Л£-[2,2',6'-2Н3]тирозин [35] и £М2,5'-2Н2]гистидин [35, 36]. DL-[2,3',5'-2H3]Th-розин получают в разбавленном растворе 2H2S04 в дейтероводе при 150°С за 20 ч [35]. Дейтерооб-мену в триптофане и фенилаланине в 2.4 н. растворе 2H2S04 в 2Н20 при 60 - 70°С и в 8.5 н. растворе 2H2S04 в 2Н20 при 180 - 190°С сопутствует рацемизация [35]. Различная способность протонов индольного кольца триптофана к 'Н-2Н-обмену (Н2 > Н5 > Н6 > Н7 > Н4) [32, 38] позволяет с высокой селективностью получать £-[2'-2Н]трипто-фан в 2Н20 при р2Н 7 и 145°С [35].
Реакция 'Н-2Н-обмена - равновесная, т.е. присутствующие в растворителе и в исходной аминокислоте протоны распределяются в соответствии с константой равновесия этой реакции, поэтому практически все приведенные выше методы получения дейтериймеченых ароматич
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.