Фармацевтические науки
Фармацевтическая химия, фармакогнозия
Раменская Г.В., доктор фармацевтических наук, профессор, зав. кафедрой Смердин С.В., доктор медицинских наук, профессор, директор Научно-исследовательского института фти-зиопульмонологии
Медведев Ю.В., кандидат фармацевтических наук, старший преподаватель Шохин И. Е., кандидат фармацевтических наук, старший преподаватель Ярушок Т.А., кандидат фармацевтических наук
Савченко А.Ю., кандидат медицинских наук, доцент Карлина В.Ю., аспирант (Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации)
МЕЖЛАБОРАТОРНАЯ ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРХЛОЗОНА В ПЛАЗМЕ КРОВИ
Изучена межлабораторная воспроизводимость при переносе методики определения инновационного противотуберкулезного средства перхлозона в плазме крови человека методом ион-парной ВЭЖХ c УФ-детектированием с хроматографической станции Waters Alliance 2695 на Agilent 1260. Показано, что основные валидационные характеристики методики (селективность, линейность, правильность, прецизионность и предел количественного определения) в аналитическом диапазоне 0,2 - 20 мкг/мл сохранили допустимые значения.
Ключевые слова: перхлозон, ВЭЖХ, плазма, валидация.
REPRODUCIBILITY OF HPLC METHOD FOR PERCHLOZONE DETERMINATION
IN HUMAN PLASMA
Method transfer for anti-tuberculosis drug perchlozone determination in human plasma using ion-pair HPLC with UV-detection was made from Waters Alliance 2695 station to Agilent 1260. It was shown that main validation characteristics (selectivity, calibration curve, accuracy, precision, lower limit of quantification) over the analytical range (0.2 - 20 pg/mL) after the transfer did not exceed critical limits.
Keywords: perchlozone, HPLC, plasma, validation.
Введение
Перхлозон - инновационное противотуберкулезное средство, разработанное в России Иркутским институтом химии имени А.Е. Фаворского СО РАН и ФГБУ «Санкт-Петербургский НИИ фтизиопульмонологии» совместно с ОАО «Фармасинтез».
Перхлозон обладает выраженным, строго избирательным ингибирующим действием на жизнеспособность микобактерий туберкулеза, чувствительных и устойчивых к существующим противотуберкулезным препаратам. Механизм действия препарата не известен. Перхлозон является малотоксичным веществом, не оказывает структурно-функциональных наруше-
ний жизненно важных органов и систем, а также раздражающего действия на слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта, не проявляет аллергенных, иммунотоксических, мутагенных свойств. Структурная формула перхлозона приведена на Рисунке 1 [1].
Рис. 1. Структурная формула перхлозона
На данный момент разработана методика количественного определения перхлозона в плазме крови методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим и УФ-детектированием с аналитическим диапазоном методики 10-10000 нг/мл для масс-спектрометрического детектирования и 250-10000 нг/мл для УФ-детектирования [2]. Так же существует методика количественного определения перхлозона методом ион-парной ВЭЖХ с УФ детектированием, которая может быть применена для определения перхлозона как у добровольцев, так и у пациентов на фоне приема других противотуберкулезных препаратов [3].
Для переноса ВЭЖХ методики было выбрано две хроматографические системы - исходная хроматографическая система: хроматограф Waters Alliance 2695 с автосамплером, термостатом колонок и диодно-матричным детектором Waters 2998 (Waters, США) под управлением программного обеспечения Waters Empower Pro 2. Хроматографическое разделение проводили на хроматографической колонке Waters Atlantis T3 150х4,6 мм, 5 мкм с предколонкой Waters Atlantis T3 4,6х20 мм. Система для переноса методики: хроматограф Agilent 1260 (Agilent Technologies, США), оснащенный градиентным насосом, термостатом колонок и образцов, дегазатором, автосамплером, диодноматричным УФ-детектором G1315D. Обработку данных проводили при помощи программного обеспечения ChemStation (ver. B.03.01). Хроматографическое разделение проводили на хроматографической колонке Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 150х4,6 мм, 5 мкм с предколонкой Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 12,5*4,6мм 5 мкм.
В данной работе продемонстрирован перенос методики определения перхлозона в крови методом ион-парной ВЭЖХ с УФ детектированием.
Материалы и методы
Оборудование
Для пробоподготовки применяли вортекс-шейкер Reax top (Heidolph, Германия), центрифугу SL 16 (Thermo Scientific, США), рН-метр Five™ FE-20 Mettler Toledo (Швейцария), аналитические весы Mettler Toledo, AL 204 (Швейцария), дозаторы переменного объема Ленпипет Дигитал 10 - 100 мкл и 100 - 1000 мкл (Россия).
Растворы и реактивы
Перхлозон, субстанция порошок, получен от ОАО «Фармасинтез», Россия (содержание перхлозона 99,7%); ацетонитрил Super Gradient, Lab-Scan Analytical Sciences; калия дигидро-фосфат (х.ч.), фосфорная кислота концентрированная (х.ч.), трифторуксусная кислота (ТФУ) концентрированная (х.ч.), октансульфонат натрия (для ВЭЖХ), вода очищенная, вода Milli-Q.
Образцы чистой и исследуемой плазмы крови хранили в морозильнике для плазмы крови (Pozis, MM-180/20/35, Россия) при температуре при температуре от -35оС до -40оС. Стандартные растворы хранили в фармацевтическом холодильнике при температуре от 2оС до 8оС (Pozis, ХФ-250, Россия).
Исходный стандартный раствор перхлозона готовили растворением навески в метаноле и хранили при температуре от -35 оС до -40 оС. Рабочие стандартные растворы готовили путем разведения исходного стандартного раствора перхлозона водой Milli-Q (Millipore, Milli-Q Advantage A10, Франция).
Пробоподготовка
В качестве способа пробоподготовки применялось осаждение белков плазмы с помощью раствора трифторуксусной кислоты (ТФУ). 150 мкл исследуемой плазмы (либо плазмы с предварительно прибавленным стандартным раствором перхлозона) вносили в центрифужные пробирки Eppendorf вместимостью 1,5 мл, прибавляли 50 мкл 50 % раствора ТФУ, перемешивали на вортекс-шейкере в течение 1 мин, центрифугировали при 15200 об/мин в течение 10 минут, после чего переносили 125 мкл надосадочной жидкости в микровиалы для ВЭЖХ.
Хроматографирование
Температура колонок в обоих системах была 25 оС. Подвижная фаза: 50 мМ фосфатный буфер с 5 мМ октансульфонатом натрия рН 2,50 - ацетонитрил (85:15). Скорость потока подвижной фазы: 1 мл/мин. Объем вводимой пробы - 50 мкл. Детектирование осуществляли при длине волны 347 ± 2 нм, с записью спектра в диапазоне 220-400 нм для системы Waters и 190-400 нм для хроматографической системы Agilent.
Результаты и их обсуждение
Существующая методика [3] определения перхлозона методом ион-парной ВЭЖХ с УФ детектированием была перенесена с системы Waters Alliance на систему Agilent 1260 HPLC без изменения состава подвижной фазы, скорости потока, объема вводимой пробы и условий детектирования. При этом была произведена замена хроматографической колонки Waters Atlantis T3 на колонку Agilent Zorbax Eclipse Plus C18.
Валидация методики
Валидацию методики при ее переносе определения перхлозона в плазме крови проводили на основании руководства по валидации биоаналитических методик FDA [4] и EMA [5], по следующим характеристикам: специфичность, линейность, правильность и прецизионность, предел количественного определения. Следует отметить, что согласно нормативным документам FDA [4] и EMA [5] при переносе биоаналитической методики на новую хрома-тографическую станцию или в другую лабораторию проводится частичная валидация методики (по основным валидационным характеристикам - селективность, линейность, правильность, прецизионность).
Селективность
Для определения специфичности хроматографических систем проводили анализ 6 образцов чистой плазмы и образца чистой плазмы с прибавлением стандартного раствора перхло-зона до получения концентрации 1 мкг/мл. На хроматограммах образцов чистой плазмы не наблюдалось пиков со временем удерживания, соответствующим времени удерживания пер-хлозона.
Линейность
Для определения линейности на каждой хроматографической системе проводили анализ 5 образцов чистой плазмы с прибавлением стандартного раствора перхлозона до получения концентраций: 200 нг/мл, 1 мкг/мл, 2 мкг/мл, 10 мкг/мл, 20 мкг/мл. По полученным значениям были построены калибровочные графики. Калибровочный график для системы Waters
(r2 > 0,998), приведен на Рисунке 2. Калибровочный график для системы Agilent (r2 > 0,99913), приведен на Рисунке 3.
Рис. 2. Калибровочный график зависимости площади пика перхлозона от его концентрации
в плазме; система Waters.
Рис. 3. Калибровочный график зависимости площади пика перхлозона от его концентрации
в плазме; система Agilent.
Отклонения концентраций калибровочных растворов, рассчитанных по уравнению линейной зависимости, от фактических значений приведены в Таблице 1.
Таблица 1
Отклонения концентраций калибровочных растворов от фактических значений
Система Waters Alliance
C факт, мкг/мл 0,2 1 2 10 20
С рассчит, мкг/мл 0,23 0,92 1,94 9,62 20,51
в, % 12,73 -8,28 -3,12 -3,85 2,53
Норма, не более 20 % 15%
Система Agilent H PLC 1260
C факт, мкг/мл 0,2 1 2 10 20
С рассчит, мкг/мл 0,18 1,03 1,91 9,86 20,72
в, % -10 3 -4,5 -1,4 3,6
Норма, не более 20 % 15%
Полученные отклонения соответствуют нормам FDA и EMA (не более 20 % для нижнего диапазона линейности, не более 15 % - для остальных точек).
Правильность и прецизионность (на уровне межлабораторной воспроизводимости) Для оценки прецизионности и правильности методик проводили анализ 3 образцов чистой плазмы с прибавлением стандартного раствора перхлозона до получения концентраций: 200 нг/мл, 2 мкг/мл, 20 мкг/мл. Каждый раствор хроматографировали 5 раз. Для полученных значений концентраций были рассчитаны величины стандартного отклонения (SD), относительного стандартного отклонения (RSD, %) и относительной погрешности (в, %), приведенные в Таблице 2.
Таблица 2
Оценка правильности и прецизионности методики
Система Waters Alliance
введено (мкг/мл) найдено (мкг/мл) найдено (мкг/мл), среднее значение (n=5) SD (n
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.