ГЕНЕТИКА, 2012, том 48, № 7, с. 812-826
ГЕНЕТИКА РАСТЕНИЙ
УДК 575.858
МЕЖВИДОВАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ В РОДЕ Paeonia (Paeoniaceae): ПОЛИМОРФНЫЕ САЙТЫ В ТРАНСКРИБИРУЕМЫХ СПЕЙСЕРАХ ГЕНОВ 45S рРНК КАК ИНДИКАТОРЫ ПРОИСХОЖДЕНИЯ ПРИРОДНЫХ И ИСКУССТВЕННЫХ ГИБРИДОВ ПИОНОВ
© 2012 г. Е. О. Пунина, Э. М. Мачс, Е. Е. Крапивская, Е. С. Ким, Е. В. Мордак, Ю. А. Мякошина, А. В. Родионов
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Ботанический институт им. В.Л. Комарова РАН, Санкт-Петербург 197376 e-mail: avrodionov@mail.ru Поступила в редакцию 26.08.2011 г.
Секвенированы районы ITS1-5.8S рДНК-1Т$2 33 образцов, относящихся к 16 видам и пяти межвидовым природным и садовым гибридам рода Paeonia L. Показано, что у гибридов пионов изогени-зации рДНК, как правило, не происходит и сохраняются рДНК обоих родителей. На хроматограмме гибридов мы видим в позициях, по которым различаются ДНК "родителей", сигналы, соответствующие двум разным нуклеотидам. Исследование таких полиморфных сайтов (PS) показало, что Р. х х majkoae является межвидовым гибридом между P. tenuifolia и P. caucasica. ITS P. hybrida отличается от ITS Р. х majkoae 19 мутациями, поэтому Р. х majkoae определенно не является синонимом P. hybrida. Сравнительный анализ Г^1-5^рДНК-Г^2 показал, что видовое разнообразие секции Paeonia основано на комбинации в результате межвидовой гибридизации трех семейств гаплотипов: гаплотипов А, характерных для геномов P. tenuifolia и P. anomala; гаплотипов В, характерных для P. mlokosewitschii и P. obovata; и гаплотипов семейства С, представленных сейчас в рДНК диплоидов и тетраплоидов некоторых кавказских и средиземноморских видов. Большая часть диплоидных пионов не имеет в ITS диморфных сайтов, но P. oreogeton, Р. cambessedesii, P. rhodia и P. daurica имеют от 10 до 17 PS — предполагаем, что это межвидовые гибриды. Большинство тетраплоидных пионов несет в ITS от 6 до 18 PS — это аллополиплоиды, один из "родительских" геномов которых близок к геному P. mlokosewitschii (B1) или геному P. obovata (B3). Второй родительский геном у P. banatica, P. peregrina, P. russii представлен геномом, близким геному Р. tenuifolia (А). P. macrophylla, P. mascula, P. coriacea, P. wittmanniana и Р. tomentosa несут в своих ядрах геном серии В и геном серии С, отдаленно родственный А-геномам.
Межвидовая гибридизация у растений, в отличие от животных, не из ряда вон выходящее событие, а один из важных факторов видообразования [1, 2]. Отдаленные межвидовые и даже межродовые гибриды у растений возникают с определенной периодичностью там, где популяции родительских видов соприкасаются или перекрываются. Часто гибриды стерильны и потому, как правило, существует всего одно поколение. Однако на основе таких гибридов в результате удвоения их хромосомных наборов могут возникать амфидиплоиды, имеющие мощный эволюционный потенциал (см., например, [3] и др.). Принято считать, что до 70% всех современных видов цветковых растений имели в своей "родословной" хотя бы однократную межвидовую гибридизацию с последующим удвоением хромосомного набора [2].
Широко распространена амфиплоидия и в роде пион (Рагота Ь.). Лишь около половины ныне существующих видов пионов являются диплои-
дами с 2n = 10 (это все кустарниковые и большая часть азиатских травянистых видов, а также оба американских вида), а остальные — тетраплоиды с 2n = 20 (это преимущественно средиземноморские, в том числе кавказские виды). Несомненно, что значительная часть тетраплоидных пионов является аллополиплоидами, возникшими в результате межвидовой гибридизации и последующего удвоения хромосомного набора гибрида [4—9]. В частности, наши исследования показали, что строение кариотипов кавказских тетраплоидов P. macrophylla, P. tomentosa [5] и, возможно, европейского и кавказского тетраплоида P. arietina [6, 9] свидетельствует об аллотетраплоидном происхождении этих видов.
Как правило, у аллополиплоидов в течение нескольких поколений происходит изогенизация рДНК, так что у аллополиплоида при ПЦР-ам-плификации выявляются рДНК только одного из "родительских" геномов [10—14]. Гены второго родителя или теряются полностью, или присут-
ствуют в геноме родителя в минорных количествах и могут быть выявлены только с помощью локус-специфичных праймеров [15]. Но геномы гибридогенных видов пионов, по-видимому, эволюционируют по другим правилам. Исследуя район Гта-5.88рРНК-ГГ82 в гене 45S рРНК пионов, Санг и соавт. [16] показали, что последовательности внутренних транскрибируемых спей-серов ITS1 и ITS2 генов 45S рРНК у некоторых видов пионов полиморфны: на хроматограмме в определенных позициях видны два сигнала одновременно — например, T и С, G и A и т.п. Санг и соавт. [16] предположили, что такие полиморфные сайты (PS) маркируют позиции, по которым различались "родительские" геномы гибридогенных видов. В данной работе мы показываем, что сравнительное исследование районов ITS и гена 5.8S рРНК ядерного генома нескольких искусственно полученных гибридов пионов подтверждает гипотезу Санга и соавт.: PS-сайты у искусственных гибридов располагаются именно в тех позициях, по которым различались родительские виды. В ходе работы нами секвенированы районы ITS всех видов пионов флоры России и бывших
1
союзных республик, в том числе три нотовида , и показано, что не только тетраплоиды, но и некоторые диплоидные виды пионов флоры бывшего СССР имеют, по-видимому, гибридное происхождение.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Секвенированы районы ITS1-5.8S рДНК-ITS2 33 образцов рода Paeonia L., относящихся к 16 видам и пяти межвидовым (как природным, так и садовым) гибридам, собранных как в природе, так и в живых коллекциях ботанических садов БИН РАН (Санкт-Петербург), ЦСБС РАН (Новосибирск), Перкальского Арборетума (ПА, Пятигорск). Два образца были взяты из гербариев MHA (ГБС, Москва) и LE (БИН РАН). Происхождение образцов показано в табл. 1. ITS 14 видов и гибридов секвенированы нами впервые. В анализ включены и часть данных по пионам, имеющихся в GeneBank NCBI (http://www.nc-bi.nlm.nih.gov/Genbank), за исключением тех случаев, когда мы считали данные GeneBank ошибочными из-за неверного определения видовой принадлежности образцов зарубежными авторами. Это касается в первую очередь бело- и желто-цветковых кавказских видов, признаки которых могут быть утрачены при сушке и хранении гербария, о чем мы писали ранее [8] и что является
1 Нотовид (nothospedes) — по правилам ботанической классификации так называют таксономическую единицу видового ранга, возникшую в результате межвидовой гибридизации. Между названием рода и названием вида в номене нотовида ставится знак х, например Paeonia х litvinskajae.
источником систематических ошибок и неточностей во всех крупнейших зарубежных таксономических обработках пионов [17—19]. Выделение геномной ДНК (одно растение на образец) проводилось по протоколу [20], с модификациями [13]. Для амплификации использовали праймеры ITS-1P 5'-aaccttatcatttagaggaagg-3' [21] и ITS-4 5'-tcctc-cgcttattgatatgc-3' [22]. Протокол амплификации: денатурация 5 мин —94°С; 35 циклов: 94°C — 1 мин, 56°С — 30 с, 72°С — 1 мин; финальный синтез 72°С — 5 мин. Секвенировали ДНК по методу Сэнджера в ЦКП БИН РАН. Анализ последовательностей проводили с помощью пакетов программ MEGA4 [23]. Построение филогенетических деревьев выполняли методом объединения ближайших соседей (NJ) и методом максимальной парсимонии (MP). В качестве показателя устойчивости дерева использовался бутстрэп-индекс (1000 репликаций), в качестве модели замен использовалась модель Kimura 2-parameter distance.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Мы секвенировали и сравнили последовательности ядерной ДНК — участок ITS1-5.8S рДНК-ITS2, включающий 654 нуклеотида у P. хmajkoae, P. hybrida, P. anomala, P. tenuifolia и других видов пионов флоры России и сопредельных территорий. Выравнивание этих последовательностей у видов Paeonia не представляет труда, так как на этом участке отсутствуют вставки и делеции нук-леотидов, а общее количество замен не превышает 3.1%. В частности, последовательности ITS1-5.8S рДНК-ITS2 у P. anomala и P. tenuifolia различаются по 16 нуклеотидным заменам, что составляет 2.5% от длины исследуемого района ядерного генома. Положение этих нуклеотидов показано в табл. 2—4. При анализе последовательностей ITS можно видеть, что у ряда видов имеется внутриге-номный полиморфизм — на хроматограмме в определенных позициях мы видим два сигнала одновременно — например, T и С, G и A и т.п. (табл. 2—4). В табл. 5 приведено число полиморфных сайтов (PS) в исследуемом районе у изученных нами видов. Эта особенность района ДНК ITS1-5.8S рДНК-ITS2 у пионов ранее была отмечена в работе [16]. Предполагается, что наличие PS свидетельствует о гибридогенной природе вида.
PSу спонтанных гибридов и культивара, полученного в результате межвидовой гибридизации
Для того чтобы проверить гипотезу Санга и соавт., мы исследовали межвидовой гибрид P. anomala х P. tenuifolia, спонтанно возникший в Ботаническом саду БИН РАН (Санкт-Петербург), и сравнили его последовательности ITS с последовательностями ITS родительских видов. У всех се-
Таблица 1. Происхождение образцов пионов
Аббревиатура, название вида, 2n Происхождение № в GeneBank
Сорт "Ballerina", 2n-? БИН РАН JN622164
P. х litvinskajae Mordak, Punina, Timukhin, 2n = 20 Краснодарский край, в лесу возле пос. Лазаревское JN622165 JN622166 JN622167 JN622168 JN622169
P. х chamaeleon Troitzky, 2n = 10 Перкальский Арборетум, Пятигорск, из Грузии JN622170
P. х majkoae Ketzch, 2n = 10 ЬЕ, образец из Тбилисского Ботанического сада JN622171
P. anomala х P. tenuifolia, 2n-? Гибрид, спонтанно возникший в Ботаническом саду БИН РАН JN622172
ANO, P. anomala L., 2n = 10 Респ. Алтай, Онгудайский р-н, склоны г. Сарлык JN622173
ЦСБС, Новосибирск, из Тувы JN622174
ЦСБС, Новосибирск, из Хакасии JN622175
ЦСБС, Новосибирск, из Кемеровской обл. JN622176
ARI, P. arietina Anders, 2n = 20 Карачаево-Черкесия, Тебердинский заповедник JN622177
CAU, P. caucasica (Schipcz.) Schipcz., 2n = 10 Краснодарский край, Сочинский р-н, в лесу возле пос. Лазаревско
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.