научная статья по теме МИЕЛОМНЫЙ ИММУНОГЛОБУЛИН ЧЕЛОВЕКА ЧЕТВЕРТОГО ПОДКЛАССА (IGG4 МАМ) СОДЕРЖИТ ФРАКЦИЮ С АСИММЕТРИЧНЫМИ СВОЙСТВАМИ С Н2-ДОМЕНОВ Химия

Текст научной статьи на тему «МИЕЛОМНЫЙ ИММУНОГЛОБУЛИН ЧЕЛОВЕКА ЧЕТВЕРТОГО ПОДКЛАССА (IGG4 МАМ) СОДЕРЖИТ ФРАКЦИЮ С АСИММЕТРИЧНЫМИ СВОЙСТВАМИ С Н2-ДОМЕНОВ»

БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 1, с. 29 - 40

УДК 578.088

МИЕЛОМНЫЙ ИММУНОГЛОБУЛИН ЧЕЛОВЕКА ЧЕТВЕРТОГО ПОДКЛАССА (IgG4 МАМ) СОДЕРЖИТ ФРАКЦИЮ С АСИММЕТРИЧНЫМИ СВОЙСТВАМИ C^-ДОМЕНОВ*

© 2015 В.М. Тищенко

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН,

142290Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3; факс: +7(4967)33-0553, электронная почта: tischen@vega.protres.ru

Поступила в редакцию 31.03.14 После доработки 02.09.14

Метастабильная долгоживущая минорная фракция была обнаружена и охарактеризована у миеломного белка IgG4 MAM методами гидро- и термодинамики. У белков этой и основной фракций имеются различия в константе седиментации. Также уровень стабильности двух Сн2-доменов у белка минорной фракции различается. Уникальные характеристики этих конформеров IgG4 MAM связаны с тем, что в процессе обмена тяжелыми цепями между молекулами IgG4 у части из них вместо двух канонических межцепьевых дисульфид-ных связей Cys226—Cys226 и Cys229—Cys229 в центральной части «шарнирного участка», по-видимому, образуется лишь одна неканоническая связь Cys226—Cys229. Это приводит к асимметричной структуре у молекул IgG4 MAM.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: иммуноглобулин IgG4, Сн2-домен, стабильность, углеводная компонента, дисуль-фидная связь.

Иммуноглобулины человека класса О, принадлежащие к четырем подклассам, являются высокогомологичными структурами, состоящими из двух идентичных легких и двух идентичных тяжелых цепей (И2Ь2) [1—4]. Каждая легкая цепь свернута в два глобулярных домена, а каждая тяжелая цепь свернута в четыре глобулярных домена, причем в середине этой цепи (между СИ1- и СИ2-доменами) имеется участок с уникальной первичной последовательностью. Л-Кон-цевые половины И-цепей и Ь-цепи образуют две антигенсвязывающие РаЪ-субъединицы, а С-концевые половины И-цепей — одну Ре-субъ-

Принятые сокращения: IgG4 MAM — миеломный иммуноглобулин человека класса G, относящийся к четвертому подклассу и полученный из пациента MAM; H (Ц)-цепи — тяжелые (легкие) цепи; CH2(3) — константные домены, образующие Fc-субъединицу (фрагмент); VH — вариабельные домены тяжелой цепи; VL — вариабельные домены легкой цепи; Fv-субфрагмент — структура, образованная парой вариабельных доменов VL—VH; гомоби-функциональный реагент DSS — дисукцинимидный эфир пробковой кислоты; гетеробифункциональный реагент SPDP — N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионат; флуоресцентная метка FITC — флуоресцеин изотиоционат, DTT — дитиотреитол; GuHCl — гуанидингидрохлорид. * Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM14-081, 28.12.2014.

единицу [5, 6], ответственную за ряд эффектор-ных функций: взаимодействие с фактором системы комплемента C1q, белками A и G, а также многочисленными клеточными рецепторами [7, 8]. В интактной молекуле Fab- и Fc-субъедини-цы соединены вышеупомянутым так называемым «шарнирным» участком. Он может быть подразделен на три сегмента: жесткую и высокостабильную «сердцевину» (core hinge) [9—15], образованную двойной поли-Ь-пролиновой спиралью, перешитой дисульфидными связями, и гибкого верхнего (upper hinge) и нижнего (low hinge) сегментов. Два последних сегмента обеспечивают внутримолекулярную подвижность Fab- и Fc-субъединиц и гибкость всей молекулы Ig, что показано как методами рентгенострук-турного анализа [11, 12, 16, 17], так и деполяризации флуоресценции [18].

Однако в последнее десятилетие было показано, что, как минимум, некоторые подклассы IgG способны еще к одному, принципиально иному виду конформационной подвижности, которая связана с перегруппировками дисуль-фидных связей и приводит к образованию кон-формеров. Так, у IgG2 в результате внутримолекулярной перегруппировки этих связей образуются конформеры, у которых одна, а затем и вторая Fab-субъединицы оказываются сближен-

ными с Fc-субъединицей [19—22]. Как показано нами ранее [23], на первом этапе этот процесс приводит к образованию асимметричной структуры IgG2, и это проявляется, в частности в том, что Сн2-домены различаются по термодинамическим свойствам.

Молекулы IgG4 согласно многочисленным данным также способны к перегруппировкам S—S-связей, но несколько иного характера. В ходе ее реализации первоначально происходит разрыв межцепочечных связей двух тяжелых цепей одной молекулы, а затем и обмен половины молекулы на аналогичную половину другой молекулы (так называемый механизм heavy-chain exchange или Fab-arm exchange) [24—27].

Возникает вполне естественный и закономерный вопрос о том, какие именно структурные изменения в молекулах IgG4 могут возникать в ходе подобных перегруппировок межцепочечных дисульфидных связей на отдельных этапах этой реакции, а также какими конформа-ционными изменениями в конкретных доменах они будут сопровождаться. Для корректного ответа на эти вопросы прежде всего необходимо попытаться получить экспериментальные данные о наличии промежуточных стадий у этого процесса (быстрых кинетических или относительно долгоживущих метастабильных), а затем при положительном ответе охарактеризовать их. Оказалось, что IgG4 MAM может находиться в промежуточном долгоживущем метастабильном состоянии, что позволило использовать для исследования комплексный подход, основанный на применении гидродинамических, оптических и калориметрических методов.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение, типирование миеломного IgG4, получение его Fab- и Fc-фрагментов и C^-доме-

нов. Миеломный IgG4 MAM был выделен из сыворотки крови больного множественной миело-мой по стандартной методике, равно как и IgG кролика и козы [28—30]. Все процедуры проводились в максимально сжатые сроки при температуре 4°. Принадлежность IgG MAM к четвертому подклассу, а его легкой цепи к А,-типу были подтверждены в тесте двойной иммунодиффу-зии в геле [31]. Количество межцепьевых дисульфидных связей и свободных SH-групп было определено с помощью 14С-йодуксусной кислоты [32]. Fab- и Fc-фрагменты из этих антител были получены путем стандартного протеолиза с использованием папаина [28—30], а затем отделены от нерасщепившегося материала хроматографией на колонке c Seperdex и друг от друга

на колонке с Mono Q [33, 34]. Fv-субфрагменты из анти-Fab-фрагментов кролика и козы были получены методом низкотемпературного протео-лиза пепсином, как описано ранее [35]. Образующие его VH- и VL-домены перешивались с помощью SPDP либо DSS по методикам, описанным ранее [36, 37]. Идентификацию Fc-фраг-ментов осуществляли иммуноэлектрофорети-чески, используя антисыворотки к легким и тяжелым цепям IgG, а также ко всем белкам сыворотки крови [38]. .N-Концевые аминокислотные остатки тяжелых и легких цепей были определены с помощью дансилхлоридного метода [39], а их С-концевые остатки — с помощью карбокси-пептидазы [40], как в наших более ранних работах [41, 42]. Белок основной фракции препарата IgG4 MAM (см. ниже) с частично восстановленными неселективным образом дисульфидными связями между H-цепями был получен и алки-лирован по методике, описанной в работе Ми-хаэлсен с соавт. [43], при 10 мМ концентрации DTT и 20 мМ концентрации йодацетамида либо 14С йодуксусной кислотой. Тяжелые и легкие цепи разделялись с помощью гель-фильтрации белка с восстановленными дисульфидными связями в 6 М GuHCl.

Сн2-Домены были получены из папаиновых Fc-фрагментов IgG4 путем трипсинового гидролиза, как описано ранее [44, 45], однако, во-первых, инкубация до протеолиза проводилась не при рН 2,5, а при рН 2,8 [45—47]. Во-вторых, с целью стабилизации лабильной структуры этих доменов гидролиз проводился в присутствии Fab-фрагментов из антител кролика против С^-доменов при соотношении CH2 : Fab 1 : 1 [47—49]. По завершении реакции комплекс CH2—Fab диссоциировали при рН 4,0 (10 мМ глициновый буфер), и два белка разделяли гель-фильтрацией при указанных условиях. Полученные таким образом фрагменты были гомогенны как по данным SDS-электрофореза [50], так и по данным двумерного иммуноэлектрофо-реза с применением коммерческих моно- и полиспецифических антисывороток по методике Лоурелл [51].

Получение антител против интактного IgG4 MAM, его Fab- и Fc-фрагментов и C^-доменов. Антитела против интактного IgG4 MAM, его Fab- и Fc-фрагментов и С^-доменов (как обычных, так и меченых флуоресцентной меткой) были получены путем иммунизации кролика и козы соответствующими белками, включая меченые [46]. Антитела против флуоресцентной метки были получены в результате иммунизации животных БСА, модифицированным FITC. Процедуры, связанные с аффинной хроматографией, выполнялись, как описано ранее [46].

Получение IgG4 МАМ, селективно меченого флуоресцентной меткой по CH2- и C^-доменам, а также гипермодифицированного белка. Для селективной модификации белков флуоресцентной меткой FITC процедура осуществлялась в 200 мМ боратном буфере (рН 8,9), содержавшем 150 мМ NaCl, в течение 12 ч при 4° при соотношении белок : метка 2 : 1 [46, 47, 49, 52]. Единственное отступление от использованной далее оригинальной методики [52] состояло в незначительном понижении рН раствора (с 9,1 до 8,9). При гипермодификации соотношение белок : метка составляло 1 : 4, а время было увеличено до 24 ч. Количество метки, включенной в Fc-фрагмент, определялось из отношения оптической плотности раствора при 495 и 470 нм

[53]. Интактные белки IgG4 MAM, у которых флуоресцентная метка была включена либо в CH2-, либо в C^-домены, были выделены, как описано ранее [46, 47], в результате аффинной хроматографии с использованием иммобилизованных антител кролика. Гипермодифицирован-ные образцы были получены в результате аффинной хроматографии с использованием антител против FITC-БСА. Все образцы белков готовились из тщательно дегазированных буферных растворов и хранились в атмосфере азота.

Определение молекулярной массы. Молекулярную массу интактного IgG4 и фрагментов определяли с помощью высокоскоростного (средневесовую массу Mw) и низкоскоростного (z-среднюю массу Mz) равновесного центрифугирования с использованием методов Ифантиса

[54] и Ван-Холда—Болдуина [55] на скоростной аналитической ультрацентрифуге «Beckman Spinco» модель E («Beckman Coulter»,

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком